[发明专利]一种以钙化海藻酸钠固载酶的优化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种以钙化海藻酸钠固载酶的优化方法。

背景技术

随着生物技术领域的发展，酶促反应越来越多的应用于工业及医药生产。然而酶促反应中最重要的元素-生物酶具有不易保存、难于回收利用等缺点。因此科学家们研究出以各种高分子固载酶的方法来解决这一问题，其中以钙化海藻酸钠固载酶的方法尤为简便易行而被广泛应用。海藻酸钠是一种天然高分子，性质温和无毒害，常温下溶于水，可与二价阳离子结合交联形成凝胶。钙化海藻酸钠固载酶的方法是将海藻酸钠与酶混合溶于水中，将此液体滴加于二价钙离子的盐溶液中形成凝胶颗粒，再将该凝胶颗粒作为一个催化整体应用于酶促反应中，如需终止反应只需将该凝胶颗粒取出进行回收利用。

然而海藻酸钠与二价阳离子的结合并不稳定，钙化海藻酸钠固载酶的凝胶颗粒经5-8次循环利用就会破碎，这样酶就无法再回收利用且污染了反应体系。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述问题。本发明公开了一种方法可有效加强钙化海藻酸钠凝胶外壳的强度，使得以钙化海藻酸钠固载酶的循环利用次数大幅增加，从而优化了该固载方法。该方法利用超临界二氧化碳处理钙化海藻酸钠固载酶的凝胶颗粒，不仅增加了酶的使用次数节省了成本，且操作过程中无任何有害物质产生，是一种易于操作、节约资源、对环境友好的优化方法。

首先将酶与海藻酸钠按一定比例混合溶于水中，将此液体以针管吸出，逐滴滴加于2％氯化钙溶液中，形成凝胶小球。将此凝胶小球冻干以备后用。其中酶与海藻酸钠最优比为1：0.2-1：0.5。

然后将冻干后的凝胶小球置于超临界二氧化碳反应釜中，加入去离子水，以超临界二氧化碳处理。最优化条件为：温度32℃-35℃；压力7.5-8.5MPa；水与凝胶小球体积比为3：1-2：1；处理时间1-2小时。

目前，超临界二氧化碳以其介于气体和液体之间的特殊流体性质多用于萃取、清洗、干燥等技术，本发明所示的方法首次提出了超临界二氧化碳应用于加固海藻酸钠固载酶外壳。同时，超临界二氧化碳临界值T=31.1℃，P=7.38MPa，在实验研究或工业应用上是较易达到的条件。

实验证明在本发明的优化方法中超临界状态下的二氧化碳可以以其特殊的流体性质穿透海藻酸钠凝胶外壳，与钙化海藻酸钠凝胶中的钙结合形成纳米级的球状碳酸钙小颗粒并附着在海藻酸钠固载酶凝胶体系的外壳，从而大大加强了该凝胶外壳的强度，使得该固载酶体系的循环利用次数大幅增加。经超临界二氧化碳处理后的钙化海藻酸钠固载酶体系的循环利用次数可由原来的5-8次提升为30次。

附图说明

附图是本发明优化方法及效果的示意图。

注释：1-酶；2-超临界二氧化碳处理前的钙化海藻酸钠固载酶凝胶小球；3-超临界二氧化碳处理后的钙化海藻酸钠固载酶凝胶小球；4-超临界二氧化碳高压反应釜。

具体实施方式

第一步：酶的固载

将海藻酸钠溶于去离子水中并充分搅拌，待搅拌均匀后，加入液态酶，充分混合。以6号针头的一次性注射器吸出后不断滴加于2％的CaCl₂溶液中，使其凝成直径为2-3mm的小球。将小球浸泡于2％CaCl₂的溶液中静置40分钟，以布氏漏斗抽滤并放于冻干机中冻干10小时。其中各原料比例为：海藻酸钠：去离子水：酶为1：200：0.2。

第二步：超临界二氧化碳处理，并以实验检测循环利用次数

超临界二氧化碳处理后钙化海藻酸钠固载酶的凝胶小球明显变得坚硬具有韧性，再以实验检测其循环利用效果。下面的实施例将结合说明书附图对本发明予以进一步说明，但并不因此而限制本发明。实施例和对比例中所得的实验结果列于表1，实施例和对比例中所用的海藻酸钠及酯水解酶均购于北京百灵威科技有限公司。

实施例

本实施例所选取的反应为标准化酯水解酶催化水解对硝基苯酚丁酸酯的反应。该反应具有反应迅速、灵敏、产率较高等优点，可快捷的检测出本发明方法的优化效果。

取制备好冻干后的固载有酶(1)的钙化海藻酸钠凝胶小球(2)0.02g放置于10ml的超临界二氧化碳高压反应釜(4)中加入2ml去离子水，使得凝胶小球与水的体积比为1：2。将反应釜密封，打入10ml超临界二氧化碳，保持体系温度在35℃、压力在7.5MPa，搅拌反应2小时。