[发明专利]利用开关型荧光能量转移体系检测多溴联苯醚残留的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用荧光共振能量转移体系与“开关型”荧光探针相结合测定痕量多溴联苯醚的方法。 

背景技术

多溴联苯醚（Polybrominated Diphenyl Ethers，PBDEs）作为一种阻燃剂被广泛应用于电子、电器、化工、交通、建材、纺织、石油、采矿等领域中。目前PBDEs已经在各种环境介质中包括大气、水体、沉积物、土壤和各种生物体(海洋哺乳动物、鱼、鸟和蛋等）和人体(奶、血清和脂肪组织等)中被检测出来，并且最近几年在世界范围环境中其含量呈快速上升趋势。相关研究表明，PBDEs具有发育毒性、生殖毒性，干扰生物体的内分泌等危害，并且部分PBDEs同系物已经建议列入全球持久性有机污染物斯德哥尔摩公约中。由于其持久性和潜在的危害性，人们对其在环境中分布、迁移、转化及其生理毒性日益关注。 

目前，国内外探究多溴联苯醚含量主要采用液相色谱法与气相色谱法，两者虽灵敏度较高，但反应条件苛刻，仪器昂贵、操作时间长且前期处理复杂。因此，发明快速、准确、选择性高的测定多溴联苯醚的方法具有重要意义。而荧光共振能量转移法作为一种新型荧光检测技术，相比于其他荧光方法，具有更高的灵敏度和选择性。本方法利用其独特的检测特性，从而建立快速、灵敏、准确的检测多溴联苯醚的方法。目前国内外应用荧光光谱法在多溴联苯醚的检测上尚未见报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种快速简单，灵敏度高，选择性好的检测多溴联苯醚的方法。 

本发明思路：以荧光增白剂作为荧光能量转移的给体，异硫氰酸荧光素作为受体，构成性能稳定的能量转移体系，荧光增白剂将能量传递给异硫氰酸荧光素，使其成为荧光强度更高的超灵敏荧光探针。而细胞色素P450同工酶1A2(CYP4501A2)可以有效地猝灭受体异硫氰酸荧光素的荧光强度，即“开关闭合”；加入多溴联苯醚后，使异硫氰酸荧光素的荧光强度升高，即“开关打开”，从而建立检测多溴联苯醚的“开关型”荧光法。 

本发明具体机理：能量转移体系的受体异硫氰酸荧光素可以标记CYP4501A2，造成荧光猝灭，并加入还原型辅酶II（NADPH）为CYP4501A2的代谢发挥活性提供电子，荧光峰几乎没有波动，而向体系中加入不同浓度的多溴联苯醚后，CYP4501A2可以代谢多溴联苯醚，使受体的荧光强度不同程度的增强，且荧光增敏量与待测多溴联苯醚的浓度在100~900微克/升范围内呈良好的线性关系。 

具体步骤如下： 

（1）多溴联苯醚混和标准溶液的配制：

用移液枪分别准确移取浓度均为50毫克/升的4-溴联苯醚、4,4`-二溴联苯醚、3,3`,4-三溴联苯醚、2,2,4,4-三溴联苯醚和2,2`,4,4`,5-五溴联苯醚各200微升到1.5毫升的棕色试剂进样瓶中，得到10毫克/升的标准溶液即多溴联苯醚溶液。

（2）检测方法： 

在9支5毫升的比色管中分别加入500微升1.0×10^-6 摩尔/升的荧光增白剂溶液和200微升1.0×10^-4 摩尔/升的异硫氰酸荧光素溶液，构成荧光共振能量转移体系；再分别加入100微升 1.0×10^-3 摩尔/升的CYP4501A2和100微升 1.0×10^-3摩尔/升的NADPH，使异硫氰酸荧光素与酶充分结合，造成荧光猝灭；最后，分别加入50、100、150、200、250、300、350、400、450微升步骤（1）所得的多溴联苯醚溶液，用pH=7.6的Tris-HCl缓冲溶液定容至刻度；比色管中多溴联苯醚的浓度分别为100、200、300、400、500、600、700、800、900微克/升；反应15分钟后用荧光光度计进行荧光强度检测，激发波长为330纳米，激发和发射狭缝宽度分别为5纳米和3纳米。

（3）标准工作曲线的绘制：