[发明专利]一种基于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的B细胞疫苗及其制备方法有效
申请号: | 201310395427.1 | 申请日: | 2013-09-02 |
公开(公告)号: | CN103463631A | 公开(公告)日: | 2013-12-25 |
发明(设计)人: | 王立新;曹萌 | 申请(专利权)人: | 东南大学 |
主分类号: | A61K39/00 | 分类号: | A61K39/00;A61K39/39;C12N5/09;C12N5/0781;A61P35/00 |
代理公司: | 南京苏高专利商标事务所(普通合伙) 32204 | 代理人: | 柏尚春 |
地址: | 210096*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 基于 hepa1 肝癌 细胞 小体 dribbles 疫苗 及其 制备 方法 | ||
1.一种基于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的B细胞疫苗,其特征是这种B细胞疫苗含有Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-Dribbles。
2.一种如权利要求1所述的基于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的B细胞疫苗的制备方法,其特征是该方法按如下步骤制备:
1)Hepa1-6肝癌细胞的培养:
复苏冻存的Hepa1-6肝癌细胞,用含10%(v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI-1640培养基,在37℃、5%(v/v)CO2的恒温培养箱中培养,每1~2天换液一次,常规0.25%(w/v)胰蛋白酶消化传代;
2)Hepa1-6肝癌细胞的处理:
待步骤1)培养后的细胞待生长良好后,加入雷帕霉素、万珂和氯化铵,雷帕霉素、万珂和氯化铵的加入量分别为100nmol/L、200nmol/L和30mmol/L,干预Hepa1-6肝癌细胞16小时,诱导Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles;
3)提取Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles:
将步骤2)诱导后的细胞经离心得到沉淀,即为Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles;
4)制备B细胞疫苗:
4a)取野生C57BL/6小鼠颈椎脱臼法处死,用75%酒精浸泡5min,放于解剖板上充分暴露腹腔,分离脾脏放入PBS磷酸缓冲盐中,用无菌磨载玻片将脾脏磨碎,经200目筛网滤过并收集脾脏单核细胞;
4b)将步骤4a)收集的脾脏单核细胞以红细胞裂解液裂解5min,PBS磷酸缓冲盐洗涤,1000rpm离心10min,收获脾脏单核细胞并制备成脾脏单核细胞悬液;
4c)将CD43Dynabeads放入15ml离心管,用分离缓冲液洗涤;
4d)取500ul4c)中洗涤过的dynabeads与4b)制备的单细胞悬液混匀中,室温孵育25min;
4e)加分离缓冲液,并吹打混匀dynabeads-脾细胞,放入磁场2min,上清液转移至另一离心管;
4f)重复步骤4e),收取上清,1000rpm离心10min,沉淀即为收获的B细胞,之后RPMI-1640培养液重悬B细胞至2×106个/ml;
4g)将制备好的B细胞与Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles混合孵育6小时,得基于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的B细胞疫苗。
3.根据权利要求2所述的一种基于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的B细胞疫苗的制备方法,其特征在于,步骤3)中,提取Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles具体包含如下步骤:
3a)将Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles及培养液倒入离心管中,低速离心1200rpm,10min;
3b)将步骤3a)离心后的上清倒入超速离心管,高速离心12000rpm,30min,4℃;
3c)将步骤3a)离心后沉淀的细胞用磷酸盐缓冲液重悬,低速离心1200rpm,10min,将低速离心后的上清再次倒入另一超速离心管中,高速离心12000rpm,30min,4℃;
3d)将步骤3b)和3c)两次高速离心后得到的沉淀用磷酸盐缓冲液重悬,合并,12000rpm高速离心30min,4℃;
3e)弃步骤3d)得到的上清,沉淀即为Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles,将沉淀用磷酸盐缓冲液重悬后分装,冻存于-20℃,备用。
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