[发明专利]黄瓜花粉半薄切片MTG-DAPI双染色观察线粒体DNA

说明书

一、技术领域

本发明是对黄瓜花粉的树脂半薄切片进行MTG(Mito Tracker Green)和DAPI双染色荧光观察的方法，涉及植物组织固定、植物花药Technovit7100树脂半薄切片技术以及荧光染色，属于生物技术领域。

二、背景技术

MTG(Mito Tracker Green)是一种线粒体(mitochondria)特异绿色荧光探针，检测时的最大激发波长为488nm，最大发射波长为516nm。MTG对线粒体的染色不依赖于线粒体膜电位既可以用于活细胞匀浆染色，也可以对固定细胞悬液进行染色。目前还没有研究将MTG应用于细胞的树脂半薄切片中线粒体的荧光染色。

DAPI即4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole)是非常优秀的DNA染料，可以透过完整的细胞膜，用于活细胞和固定细胞的荧光染色，广泛应用于细胞凋亡检测、多色流式细胞试验、细胞器DNA分布检测等细胞学研究领域。当DAPI与双股DNA结合时，最大吸收波长为364nm，最大发射波长为454nm，紫外光下激发呈现蓝色荧光。

不同于绝大多数植物细胞器的母系遗传规律，黄瓜种内及种间杂交研究结果表明黄瓜线粒体为父系遗传。因此可以推测黄瓜花粉发育过程中的生殖细胞包含有线粒体基因组并通过受精过程遗传给子代，但目前并无细胞学证据。

本发明选用黄瓜贴壁期(生殖细胞营养细胞共存)花粉，通过对DNA及线粒体膜进行特异双染色，确定线粒体DNA在黄瓜花粉中的存在和分布情况。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种黄瓜花粉半薄切片的荧光双染色方法，有效地确定黄瓜花粉发育过程中线粒体DNA的增减和分布情况，该方法也可以应用于其他植物材料和组织中线粒体DNA的观察，为其他植物材料中线粒体DNA的荧光观察提供依据。

技术方案

本发明提供一种对黄瓜花粉的Technovit7100(Kulzer and Co.，Wehrheim，Germany)树脂半薄切片进行MTG-DAPI双染色的方法，是通过花药固定、Technovit7100树脂包埋、树脂样品半薄切片和双染色步骤来完成，其具体步骤如下：

1.Technovit7100树脂包埋样品的制备：

1)花朵采集：采集新鲜的大小不同的黄瓜花朵，收集于湿润的吸水纸中，根据花朵的大小将其划分为各个不同的发育时期。

2)醋酸杨红染色液的配置：将1克洋红溶于100毫升冰醋酸后，将溶液与一小块锈铁加热至沸腾(锈铁的加入能增强染色效果)即可。

3)固定液的配置：溶液包括2.5％的戊二醛，0.1M磷酸缓冲液(pH=7.2)。

4)用醋酸洋红染色确认花粉的发育时期：在载玻片上滴20微升醋酸洋红溶液，用镊子将花粉从花药中挤入醋酸洋红溶液中，并将盖玻片盖于其上。于酒精灯上加热烤片(注意不要沸腾)。然后将染色过的载片于显微镜下观察，用以判断花粉的发育时期(四分体、单核、单核靠边、贴壁、变圆、成熟)。各个发育时期的花朵分别固定于2.5％戊二醛溶液中，抽真空后4℃保存，固定时间不少于12小时。

5)清洗固定液：取固定液中各发育时期的花朵，将其放置于载玻片上，用镊子取下花药并转移至1.5毫升EP管中(注意尽量去除非花药结构的杂质)。吸弃固定液，用1毫升0.1M PBS缓冲液将固定后的花粉清洗4遍，用蒸馏水清洗一遍，每次清洗时间为20分钟。

6)样品梯度脱水：15％的酒精对样品脱水30分钟，30％的酒精1小时，50％的酒精过夜，70％的酒精1小时。对不同花粉发育时期的样品，每个挑选5个左右于1.5ml EP管中用85％的酒精脱水1小时(剩余的样品于70％的酒精中保存于-20℃冰箱)，90％的酒精1小时，95％的酒精1小时，每30分钟更换一次，100％酒精(无水硫酸铜处理过)2小时，中间更换两次溶液。

7)预渗透液和渗透液的配置：预渗透液的组成为Basic Liquid：无水乙醇=1：1。渗透液由100毫升的Basic Liquid与1克的Hardener I构成，4℃可保存4周。

8)预渗透：脱水后的花药置于预渗透液中室温静置3小时。

9)渗透：将材料转入渗透液中常温下渗透过夜。

10)新鲜配置包埋液：每500微升渗透液加33微升Hardener II，快速轻轻混匀，需现配现用。