[发明专利]一种α1-AR亚型选择性拮抗剂的高通量筛选细胞模型及其构建方法与应用有效
| 申请号： | 201310397254.7 | 申请日： | 2013-09-04 |
| 公开（公告）号： | CN103484498A | 公开（公告）日： | 2014-01-01 |
| 发明（设计）人： | 袁牧;许芳;黎枭;徐静仪;朱着;何雪兰;朱柳;陈洪;黄碧云 | 申请（专利权）人： | 广州医科大学 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N5/10;C12Q1/02 |
| 代理公司： | 广州粤高专利商标代理有限公司 44102 | 代理人： | 谢敏楠 |
| 地址： | 510182 *** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 sub ar 选择性 拮抗剂 通量 筛选 细胞 模型 及其 构建 方法 应用 | ||
1.一种α1-AR亚型选择性拮抗剂高通量筛选细胞模型，其特征在于，其构建方法为：将α1-AR三种亚型α1A、α1B和α1D的真核表达质粒、报告基因和内参质粒共转染宿主细胞，建立瞬转细胞模型；所述报告基因采用G蛋白偶联受体的响应元件CRE、NFAT-RE、 SRE、AP-1或NF-кB中的任意一种与荧光素酶、β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶报告基因中的任意一种共同构建于一个载体上制备得到；所述内参质粒为含有内参SV40的质粒。
2.根据权利要求1所述细胞模型，其特征在于，所述报告基因采用G蛋白偶联受体的响应元件CRE与荧光素酶共同构建于一个载体上制备得到。
3.根据权利要求2所述细胞模型，其特征在于，所述报告基因采用G蛋白偶联受体的响应元件CRE与荧光素酶共同构建于真核表达载体pGL3或pGL4上制备得到报告基因pGL3[luc2P/CRE/Hygro]或pGL4[luc2P/CRE/Hygro]。
4.根据权利要求1所述细胞模型，其特征在于，所述宿主细胞为人体肾脏细胞HEK293、PC12细胞或CHO细胞。
5.根据权利要求1所述细胞模型，其特征在于，所述内参质粒为pRL-SV40[hRluc/TK]、pRL-TK[hRluc/TK]、pRL-CMV[hRluc/TK]、pRL-null[hRluc/TK]或pGL4[hRluc/TK]。
6.根据权利要求1至5任一项所述细胞模型，其特征在于，其构建方法为：将α1-AR三种亚型α1A、α1B和α1D的真核表达质粒、报告基因pGL3[luc2P/CRE/Hygro]或pGL4[luc2P/CRE/Hygro]和内参质粒pRL-SV40[hRluc/TK]、pRL-TK[hRluc/TK]、pRL-CMV[hRluc/TK]、pRL-null[hRluc/TK]或pGL4[hRluc/TK]按照1:1:1～10:100:1的比例共转染汇合度为90%以上的HEK293细胞18～22小时，建立瞬转细胞模型。
7.一种利用权利要求1至6任一项所述细胞模型在筛选α1-AR亚型选择性拮抗剂中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，利用权利要求1所述细胞模型高通量筛选α1-AR亚型选择性拮抗剂的方法为：向细胞模型中加入待筛选药物30～60后，再加入激动剂，共培养8～10h后，裂解细胞，取细胞裂解液测定报告基因和内参的相对表达量，以此来评价该药物对α1-AR1-AR三种亚型α1A、α1B和α1D 的抑制活性。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述激动剂为10-6～10-5M激动剂苯肾上腺素或去甲基苯肾上腺素。
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