[发明专利]金黄杆菌及其羰基还原酶用于阿瑞匹坦手性中间体生产

说明书

技术领域

本发明属于应用微生物与酶工程领域，具体涉及一株金黄杆菌及其基因组编码的一种新型羰基还原酶，并利用该菌或者这种羰基还原酶作为生物催化剂生产阿瑞匹坦手性中间体。 

背景技术

光学活性(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇是Merk公司研发的药物阿瑞匹坦（Aprepitant，商品名“Emend”）的关键手性中间体。阿瑞匹坦的主要功能是预防和治疗化疗引起的急性或延迟性呕吐。 

目前制备该手性中间体的主流工艺是化学合成。近年来，随着生物催化技术的不断发展，研究者们积极探索采用酶催化前手性酮的方法生产该中间体，筛选到了一些对映体选择性>99%的微生物菌株，包括Lactobacillus Kefir、Aspergillus niger（Tetrahedron：Asymmetry，2006,17,2000-2005），Penicillium expansum（Tetrahedron：Asymmetry，2009,20,2759-2763），Leifsonia xyli HS0904（Appl Microbiol Biotechnol,2011,90,1897-1904），氧化微杆菌Microbacterium oxydans C3（专利号ZL201010271579.7），以及选择性稍差的热带假丝酵母菌Candida tropicalis20216（ee值>92%，Tetrahedron,2004,60,789-797）等。但是，这些报道都是以微生物菌株全细胞作为生物催化剂，可转化的底物浓度较低，目前仅有Leifsonia xyli HS0904转化的底物浓度较高，最高可转化 的底物浓度为51g/L，30h的转化率为91.8%（J.Microbiol.Biotechnol.2013,23(3),343-350）。考虑产物分离纯化成本问题，这些菌株的转化能力与实际应用还有较大的距离。 

为获得高效的前手性酮催化工艺，首先应解决高效高选择性酶源问题，从环境中筛选新型微生物菌株作为催化剂是常用的有效途径之一。然而原始菌株直接转化可能存在安全性、遗传稳定性问题，原始菌株可能继续利用醇产物导致产物产量低以及原始菌株内的其他酶可能对底物作用生成副产物等问题，因此将原始菌株的关键羰基还原酶基因克隆并异源表达，以重组菌或者酶用于生物转化则可避免上述问题，且这种催化体系较为简单，稳定，产物分离提纯容易，易于工业化。 

发明内容

本发明的目的是公开一种新筛选的金黄杆菌CA49（Chryseobacterium sp.CA49），及其所产高活力高对映选择性羰基还原酶ChKRED20，并利用该菌或者该酶还原底物3,5-双三氟甲基苯乙酮制备光学纯(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇，从而以生物催化的方法制备高光学纯度的阿瑞匹坦手性中间体。该菌从果园土壤中富集、分离并经过多轮筛选后获得。关于该菌的保藏信息是：保藏号为CCTCC M2012484；分类命名为金黄杆菌CA49（Chryseobacterium sp.CA49）；于2012年11月27日在中国典型培养物保藏中心保藏，地址是湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。 

基于上述发明目的，本发明首先提供一种金黄杆菌CA49（Chryseobacterium sp.CA49），保藏编号为CCTCC M2012484）。 

本发明还提供了上述金黄杆菌CA49（Chryseobacterium sp.CA49） 的筛选方法，所述筛选方法为：于果园采集土样，以3,5-双三氟甲基苯乙酮为唯一碳源，经2轮富集筛选获得可能的产酶菌株。将初筛菌株培养后，以休止细胞为催化剂转化底物，测定产物生成量和产物对映体过量值，并将产物对映体过量值高的菌株进行进一步的鉴定，得到本发明涉及的金黄杆菌。 

本发明还提供一种上述金黄杆菌CA49（Chryseobacterium sp.CA49）作为生物催化剂在转化底物3,5-双三氟甲基苯乙酮生成(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的应用。 

具体地，上述用途的操作方法为：将筛选的金黄杆菌CA49（Chryseobacterium sp.CA49）培养后，收集菌体，以休止细胞作为催化剂，并添加异丙醇和葡萄糖作为辅酶循环底物，底物3,5-双三氟甲基苯乙酮经生物转化后得到(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇，产物的对映体过量值>99%。