[发明专利]一种基于RNAi技术及rescue原理制备的siRNA和突变型克隆载体

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于RNAi rescue原理制备突变型克隆载体的方法。 

背景技术

RNAi（RNA interference，RNA干扰）是一种高效的特异性强的基因阻断技术，通过切断目的基因mRNA达到沉默目的基因的作用，RNAi技术是一种新兴的基因研究工具，目前已经被广泛常规应用于各种领域的基因功能研究。 

随着研究深入发现RNAi存在比较普遍的脱靶现象，为了证实沉默的是否为靶基因，人们采用不同的RNAi靶点证实获得相同的基因功能结果来证明对目的基因进行了特异性沉默，但这种方法存在所设计的RNAi靶点均发生脱靶的几率，如果所设计的RNAi靶点均发生脱靶，则无法证明对目的基因是否进行了特异性沉默。 

另一种方法就是构建RNAi target区突变体，即对该区的碱基序列进行同义突变，一方面不被RNAi沉默，一方面能保证表达的蛋白与内源、野生型载体表达的蛋白功能一致，该方法被称为RNA干扰回复（即：RNAi rescue）技术。通过RNA干扰回复技术对基因表达进行回复，如果回复的结果和RNAi的结果相反，则可以确认该基因功能。RNA干扰回复方法在设计上更加科学，也更加严格。对于RNA干扰回复的应用目前报道不多，其主要原因在于获得突变型过表达载体的关键技术不够成熟。 

发明内容

本发明的目的在于构建沉默SPP1基因表达的小干扰RNA，以及针对该RNAi的靶序列构建的突变型克隆载体，该突变型克隆载体能够避免RNAi沉默，同时该突变型克隆载体能够表达正常功能的蛋白；两者结合可用于SPP1基因功能的研究。 

本发明首先提供了一种降低SPP1基因表达的小干扰RNA（siRNA），包括正义链和反 义链，序列如下： 

正义链：5’-CCAUUCUGAUGAAUCUGAU-3’（SEQ ID NO:1）； 

反义链：5’-AUCAGAUUCAUCAGAAUGG-3’（SEQ ID NO:2）。 

进一步的，本发明所述小干扰RNA针对的SPP1基因上的RNA干扰靶序列如SEQ ID NO：3所示。 

一种降低SPP1基因表达的shRNA，所述shRNA含有SEQ ID NO：1所示序列的正义链片段和SEQ ID NO：2所示序列的反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构。 

进一步的，所述降低SPP1基因表达的shRNA可剪切成前述含有如SEQ ID NO：1所示正义链以及SEQ ID NO：2所示反义链的降低SPP1基因表达的siRNA。 

优选的，所述茎环结构的序列可选自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU和CCACACC。 

一种SPP1基因干扰慢病毒载体，含有编码前述降低SPP1基因表达的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA，并剪切获得如SEQ ID NO：1-2所示序列的siRNA。 

所述SPP1基因干扰慢病毒载体是将编码前述SPP1基因shRNA的DNA片段克隆入已知载体获得，所述已知载体多为慢病毒载体，所述SPP1基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞，进而转录出所述shRNA，通过酶切加工等步骤，最终获得所述SPP1基因小干扰RNA，用于特异性沉默SPP1基因的表达。 

进一步的，所述慢病毒载体可以选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。