[发明专利]一种短须裂腹鱼心脏细胞系的构建和超低温冷冻保存方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种短须裂腹鱼心脏细胞系的构建和超低温冷冻保存方法，属淡水水生生物细胞培养和超低温冷冻保存技术领域。

背景技术：

鱼类细胞培养起于20世纪60年代，发展至今形成了一套包括培养基、抗生素、原代培养和传代培养方法等相对完善的细胞培养体系，截止目前，已建立了280余株细胞系。我国鱼类细胞培养历经30余年，也只建立了50余株鱼类细胞系，涉及的种类有约30种，主要以海洋种类为主。从以上事例可以看出，一套成熟的细胞培养技术流程并不是一株细胞系建立成功的必备条件，成熟的技术流程并不能使细胞培养获得成功，细胞培养仍然需要从提供原代细胞物种本身的生物学特性入手，经过艰苦的野外调查和大量的室内实验，对细胞培养体系的培养条件进行调整，找到最优的培养条件，才能使细胞培养获得成功。云南土著淡水鱼类近600种，占中国淡水鱼类的50%，因此，云南土著鱼类种质资源保存显得尤为重要，但细胞培养研究鲜见报道。

短须裂腹鱼Schizothorax wangchiachii（Fang，1936）隶属于鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、裂腹鱼亚科(Schizothoracinae)、裂腹鱼属(Schizothorax)，俗名，面鱼、细甲鱼，主要分布在乌江、金沙江及雅砻江。短须裂腹鱼为底栖鱼类，一般生活在水流较急的峡谷河流之中，在支流多见于急流冲击的深潭中，是当地名贵的野生鱼类，近年调查结果显示，虽在其分布区还有一定数量，但其产量已大大降低。2007年云南水产研究所人工繁殖成功，但存在的主要问题是：鱼苗鱼种十分容易感染小瓜虫病和水霉病，而且一旦感染就迅速蔓延，尤其是小瓜虫病极其难治愈，由此导致苗种大量死亡。同时，野外引种个体需要一段时间才能适应塘养环境，而此适应阶段是各种疾病的爆发期，造成引种个体死亡。因此，病害防治是短须裂腹鱼人工养殖的关键问题，而细胞生物学是研究病毒作用机理的有效手段。另一方面，由于养殖鱼类本身的局限性，塘养环境下人工繁殖易造成染色体异常，如多倍化和异倍化，需要细胞短期培养用于核型分析以检测人工繁殖品种的质量。因此，需要研究一种短须裂腹鱼细胞系的构建方法，建立短须裂腹鱼细胞系。

经文献检索，未见与本发明的相同报道。

发明内容：

本发明的目的是提供一种操作简便易行的短须裂腹鱼心脏细胞系的构建和超低温冷冻保存方法，以满足对短须裂腹鱼种质资源保存和理论研究的需要。

本发明的短须裂腹鱼心脏细胞系的构建和超低温冷冻保存方法，其具体步骤如下：

（1） 制备PBS消毒液和细胞培养液

PBS消毒液：向PBS中加入抗生素，使青霉素浓度为200IU/ml，链霉素浓度为200μg/ml，两性霉素B浓度为20 μg/ml；

基础培养液：向M199培养液中加入胎牛血清，使胎牛血清体积占总体积的10%；

原代培养液：向M199培养液中加入胎牛血清、细胞生长因子bFGF和抗生素，使胎牛血清体积占总体积的15%，bFGF浓度为10ng/ml，青霉素浓度为150IU/ml，链霉素浓度为150μg/ml，两性霉素B浓度为20 μg/ml；

传代培养液：向M199培养液中加入胎牛血清、细胞生长因子bFGF和抗生素，使胎牛血清体积占总体积的15%，bFGF浓度为6ng/ml，青霉素浓度为100IU/ml，链霉素浓度为100μg/ml，两性霉素B浓度为10 μg/ml； 

调节上述培养液的pH值为7.0-7.2，放置于4℃冰箱中保存备用；

（2） 原代培养

以75%的酒精消毒1龄健康短须裂腹鱼鱼体，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其心脏，置于无菌培养皿中，PBS消毒液清洗心脏组织3次后，用无菌器械剪成组织小块，然后用2ml 0.2%胰蛋白酶-EDTA消化6 min，用0.2ml胎牛血清中和胰酶反应，1000rpm离心收集心脏组织块，再在心脏组织块中加入2ml 0.1%Ⅳ型胶原酶消化1h，1200rpm离心收集心脏组织块及细胞，原代培养液重悬，并将其接种于25 cm²细胞培养瓶中，于18℃培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，以除去未贴壁的组织和死细胞；

（3） 传代培养