[发明专利]灰树花270菌株粗多糖在抗禽流感H5N1上的应用

说明书

技术领域

本发明涉及灰树花270菌株粗多糖在抗禽流感H5N1病毒上的应用，尤其涉及灰树花270菌株，已于2013年8月26日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”， 保藏编号为CGMCC No.8116，分类名称为灰树花 Grifola frondosa，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。 

背景技术

关于灰树花270菌株粗多糖在抗禽流感H5N1病毒上的应用，经检索到的相关专利有：中国专利申请号为99112556.8 灰树花发酵液多糖提取方法， 02136517.2 灰树花发酵工艺及其多糖肽的生产方法，89105471 一种云芝糖肽（PSP）的生产方法，92109345 香菇多糖及香菇菌多糖提取工艺，96109095中国灵芝保健饮料，92111030灵芝营养保健液及其制法，93103116灵芝口服液等专利，这些专利内容大多以提取多糖为主要目的，灰树花、云芝和灵芝三种所制备的活性物质提取物具有抗肿瘤、抗高血压、降低血糖、抗肥胖、抗肝炎等药效，但对于抗病毒作用鲜有报道，而对于抗禽流感H5N1病毒的报道更是没有检索到。 

发明内容

本发明要解决的问题是，针对上述灰树花菌株以及其制备的粗多糖的药理作用所存在的不足，提供灰树花270菌株粗多糖在抗禽流感H5N1病毒上的应用。利用本发明的方法提取的灰树花270菌株粗多糖对禽流感H5N1病毒具有抑制作用，并且对正常细胞具有保护作用。 

所述的灰树花270菌株粗多糖在抗禽流感H5N1病毒上的应用，其特征是，所述灰树花270菌株粗多糖由下述方法制得： 

(1)加热提取：取经液体发酵或固体发酵的灰树花270发酵全液或菌丝体或澄清液放于容器内，加入纯净水调整其pH值为8～12，置60～120℃下加热100～240分钟，

 (2)过滤：之后冷却、以180～200目的筛网过滤灰树花菌丝体，收集滤液，滤渣以其4～8倍体积的蒸馏水稀释，重复上述操作1～2遍，再收集滤液；

(3)减压浓缩：合并收集的滤液，在温度50～70℃，压力0.2～0.6Kg/cm²，真空度为0.02～0.06Mpa的条件下进行减压浓缩，使滤液浓缩至原有体积的1/10～1/20；

(4)除色素：取浓缩后的提取液，用氨水调pH至6.0～8.0，于30～45℃下搅拌，按每10ml滴加1ml～2ml 10 %～30%的H₂O₂，进行脱色10～24h，得到淡黄色液体， 

(5)除小分子化合物：然后利用透析袋，截留分子量3000～5000以上，4℃～10℃条件下透析24h～48h，去除多余的H₂O₂、小分子化合物。

(6)除脂肪：取上述提取液，装入索氏提取器,按1：0.5～1的比例加入石油醚，加热回流提取2～6h,待冷却后，弃去石油醚层，回收余下的提取液。 

(7)醇析：在回收的提取液中，加入量为其体积4～8倍的95%乙醇溶液并不断搅拌，搅拌速度为30～60r/min，10～20分钟后，静置24～48小时进行醇析； 

(8)离心分离：醇析后弃上清液，沉淀物移入离心管中，以转速为3000～5000r/min离心20～30min，离心后弃去上清液，收集离心沉淀物；

(9)收集物干燥：将上述收集的离心沉淀物，在50～70℃温度条件下干燥36～48小时； 

(10)收集物粉碎：取上述烘干的收集物，进行粉碎，经200目筛网过筛后即为灰树花粗多糖。

其中，所述的灰树花270发酵全液是指灰树花270菌株发酵液与菌丝体的集合体。 

步骤 所述的灰树花270菌丝体是指灰树花270菌株液体发酵和固体发酵所得的菌丝体 

所述灰树花270菌株通过以下步骤进行发酵：

（1）液体种子培养：采用500毫升三角瓶，每瓶装200毫升液体培养基，将10%的灰树花菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，调节pH为3-8，培养温度为20-35℃，摇瓶转速为80-280r/min，培养7-15天，即可得到灰树花液体种子；