[发明专利]火木层孔菌中环二肽C5在抗禽流感H5N1病毒上的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗禽流感H5N1病毒的火木层孔菌中活性物质的提取制备方法，尤其涉及的火木层孔菌菌种，已于2013 年8月26日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”， 保藏编号为CGMCC No.8108，分类名称为火木层孔菌 Phellinus igniarius，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。 

背景技术

    通常生物学中所指的环肽是指以氨基酸肽键形成的化合物，在植物化学中这一概念被扩大成以酰胺键形成的一类化合物，因此范围被扩大至包括有机胺类和大环生物碱类，根据成环与否分为环肽和直链肽。 已报道的环肽类化合物具有多方面的生物活性，包括抗肿瘤、抗HIV、抗菌、抗疟、安眠、抑制血小板聚集、降压、抑制酪氨酸酶、抑制环氧化酶、抑制脂质过氧化酶、雌性激素样、免疫抑制等生物活性。 

    由于环肽的前体-直链肽所包含的氨基酸的数目和种类的千差万别，造成了环肽合成方法的多样化。对某种直链肽表现出高效，快速缩合作用的试剂和方法对另外一种肽链就可能变得低效或无效。 

    一种环二肽具有抗菌等多种重要的生理活性，如今，未见到有抗情流感病毒活性的报到。 

发明内容

本发明公开了一种从药用菌中分离的具有抗禽流感活性的一种环二肽C5。本发明首次公开了这种一种环二肽的一种新活性，证明其具有抗禽流感作用。 

本方法较一般化合物应用的优点在于：发现了该种一种环二肽C5的新活性，具有抗禽流感病毒的作用。 

本发明的技术方案如下： 

首先制备火木层孔菌粗提物，由下述方法制得：

(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是：

玉米淀粉    1-5%             葡萄糖      1-5%

蛋白胨     0.1-0.5%          酵母膏     0.1-0.5%

硫酸镁     0.1-0.5%          磷酸二氢钾 0.01-0.05%

(2)将火木层孔菌菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20～35℃温度，摇瓶转速为80～280r/min，pH 3～8条件下，震动培养7～15天；培养中当pH值降到2.5～4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20～35℃，发酵罐压力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH 3～8，通气量0.5～1.1vvm，搅拌速度100～280转/分的条件，培养7～15天，即可利用火木层孔菌菌丝体发酵全液制备火木层孔菌粗提物。

(3)取步骤(2)中所得火木层孔菌菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2～1/5； 

(4)用体积百分比为60～95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2～8倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60～90%，乙醇优选为浓度65-95%的食用乙醇，所用体积优选为浓缩液体积的3-6倍；

(5)对步骤(4)所得提取液在50～70℃条件下，加热1～2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5～1/10；

(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得火木层孔菌粗提物。

然后从火木层孔菌粗提物中环二肽C5，步骤如下：火木层孔菌粗提物→正相硅胶层析→氯仿与甲醇梯度洗脱→TLC检测→甲醇凝胶层析→正相硅胶层析→TLC检测→反相硅胶层析→中压反相层析→HPCL检测→减压蒸干→环二肽C5。 

具体步骤为： 

(1)制备火木层孔菌粗提物；

(2)将上述步骤（1）所得的粗提物与正相硅胶混匀搅拌，并干燥，进行硅胶正相柱层析，用洗脱剂洗脱2-5次；

(3)收集上述步骤（2）所得的最后一次洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥；

(4)将步骤（3）得到的产物再次进行一次正相硅胶层析，用洗脱剂洗脱；

(5)将步骤（4）得到的产物进行反相硅胶层析，用洗脱剂洗脱；

(6)将步骤（5）得到的产物进行中压反相制备，用洗脱剂洗脱；

(7)收集洗脱液，HPLC检测，减压干燥，即为环二肽C5。