[发明专利]一种烟草疫霉菌分子检测引物及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种烟草疫霉菌分子检测引物及其检测方法，专用于烟草疫霉菌高灵敏度快速分子检测，同时可用于田间烟草黑胫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。

背景技术

由烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae Breda de Haan)引起的烟草黑胫病是一种毁灭性世界病害。1896年van Breda de Haan在印度尼西亚的爪哇首次发现，此后该病流行蔓延迅速，1922年便成为美国的佛罗里达、堪萨斯州烟区的严重病害。1924年后，该病己遍布于全世界温带、亚热带和热带地区烟田。中国于1950年首次报道，当时该病发生在黄淮烟区，目前各主要产烟区均有不同程度的发生，其中安徽、山东、河南为历史上的重病区；云南、贵州、四川、湖南、广东、广西、福建等南方烟区发生亦相当普遍，平均发病率为5％-12％，严重田块发病率高达75％，甚至造成绝收。烟草疫霉的寄主范围很广，可以侵害数百种植物，病害通常在潮湿、多雨条件下发病重，潜育期短，可多次再侵染，传播与蔓延迅速，常造成寄主植物成片死亡。近年来，由于我国连作烟田面积不断扩大，连作年限不断增加，加重了该病害的流行，我国平均每年因烟草黑胫病造成的经济损失达1亿元以上，仅次于烟草病毒病。该病属于维管束系统性病害，一旦发生就很难控制，对烟草威胁极大，并常与其他烟草根茎部病害混合发生，给病害的诊断造成困难，而生产上则常因不明发病原因，难以有针对性的防治措施，故造成更为严重危害。因此建立烟草疫霉菌快速检测体系，早期对发病植株及土壤进行疫霉菌快速准确检测，对预测病害发生情况、及时采取有效的防治措施控制病原菌的传播和流行、减少经济损失都具有重要的理论和实际意义。

传统烟草疫霉菌的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特性等，程序繁琐，所需时间较长，鉴定时还易受人为及环境等诸多因素的干扰，而且不能直接从植物组织中检测出病原菌，难以满足病害控制中快速、灵敏、稳定的检测要求，很容易错过病害防治的最佳时期，而免疫血清学鉴定方法虽已建立，但是特异性较差，常常受到抗血清质量的影响，容易造成假阳性，因此这些方法的应用均受到一定的限制。

近年来随着分子生物学技术的发展，以聚合酶链式反应（PCR）技术为代表的分子检测方法得到了迅速的发展和应用，PCR技术的应用在很大程度上弥补了传统方法的不足，这类方法普遍具有特异、灵敏、快速且不需要进行病原菌分离培养的特点，可用于烟草疫霉引起病害显症之前的早期监测。

利用核糖体转录间隔区（rDNA-ITS）基因序列在物种进化过程中的保守性和异变性设计引物进行PCR扩增已在棉花、番茄、西瓜等作物的病害检测中得到了广泛的应用。但是越来越多的研究发现，在疫霉属中，部分疫霉菌种间ITS序列差异很小，以ITS为靶标设计的引物难以将这部分疫霉菌与其近缘种区分开，因此要对烟草疫霉菌进行高灵敏性和特异性检测，应从疫霉菌其它基因上设计引物。已有的研究表明，疫霉菌属中的YPT1基因（ras-related protein）是一个与原癌基因Ras(Rat sarcoma)相关的基因，在酵母中，该基因编码一个与Ras相关的GTP结合蛋白。YPT1基因包含有多个外显子和内含子，多个外显子具有保守性，而这些内含子在不同种之间具有多变性，非常适合于设计引物进行疫霉属卵菌近缘种的分子检测，区分不同种的疫霉菌。Schena等分析了29个疫霉种43个菌株的YPT1基因的序列，认为YPT1基因作为疫霉菌分子检测的靶标基因在理论上是可行的。

因此，可以通过测定烟草疫霉菌及其它疫霉菌的YPT1基因，并进行多重比对分析，来鉴定烟草疫霉菌。该检测方法目前尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中烟草疫霉菌的生物学检测方法特异性差，灵敏度低、所需周期长、免疫血清学鉴定方法容易造成假阳性的问题，提供烟草疫霉菌特异分子检测引物以及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的烟草疫霉菌快速分子检测的方法。

实现本发明的目的包括下列步骤：

1．通过测定烟草疫霉菌及其它疫霉菌的YPT1基因，并进行多重比对分析，设计了对烟草疫霉菌具有特异扩增作用的1对PCR引物，即特异分子检测引物的序列为：

上游引物YhF: 5'- GACATGATATCAACTGTTCTGCAG -3'

下游引物YhR: 5'- CCTTGGATCTTCTCTCGATAAG -3'

对烟草疫霉菌特异性扩增出342 bp的产物。