[发明专利]一种生物学评价受污染水体质量的方法

权利要求书

1.一种生物学评价受污染水体质量的方法，其特征在于，采用hsp70基因的表达模式进行水体质量评价。 

2.根据权利要求1所述的一种生物学评价受污染水体质量的方法，其特征在于，包含以下步骤： 

1）克氏原螯虾的预养：取体重为20g-30g的活的克氏原螯虾，在试验室水族箱中用经过灭菌处理的自来水饲养1天-2天，获得预养克氏原螯虾； 

2）污水水样的预处理：将采集来的污水水样进行稀释，并且平均分为3组，获得稀释后的3组水样； 

3）克氏原螯虾的胁迫刺激试验：将步骤（1）中的预养克氏原螯虾放入步骤（2）稀释后的3组水样之中，进行胁迫刺激，取样时间点分别为胁迫刺激开始之后的6h、12h、24h、48h、72h、96h，获得各个取样时间点对应的胁迫刺激的克氏原螯虾； 

4）克氏原螯虾总RNA的提取：对于步骤（3）中的各个取样时间点对应的胁迫刺激的克氏原螯虾进行肝脏取样，要求每只克氏原螯虾肝脏的取样量为20mg-30mg，而且要求一个取样时间点上取3-5只克氏原螯虾的肝脏组织混合在一起之后，进行总RNA的提取，获得各个取样时间点对应的胁迫刺激的克氏原螯虾肝脏总RNA样品； 

5）克氏原螯虾cDNA的反转录合成：将步骤（4）中的各个取样时间点对应的胁迫刺激的克氏原螯虾肝脏总RNA样品进行反转录合成cDNA，获得各个取样时间点对应的克氏原螯虾肝脏组织cDNA样品； 

6）实时荧光定量PCR技术确定克氏原螯虾hsp70基因的表达模式：以步骤（5）中的各个取样时间点对应的克氏原螯虾肝脏组织cDNA样品作为模板，进行实时荧光定量PCR反应，使用的引物分别为hsp70基因的一对引物hsp70-qRT-F：5`-caccagatgaaggagttg-3`和hsp70-qRT-R：5`-aatgaaacactttcaggt-3`和作为内参的18S rRNA基因的一对引物18S-qRT-F：5`-tcttcttagagggattagcgg-3`和18S-qRT-R：5`-aaggggattgaacgggtta-3，实时荧光定量PCR反应结束之后，获得反应过程对应的溶解曲线，并且进行Ct值读数，获得各个取样时间点对应的Ct值； 

7）数据分析：对步骤（6）中获得的各个取样时间点对应的Ct值数据进行分析，以正常的没有经过污水胁迫刺激的克氏原螯虾作为0h对照组，具体分析方法为：数据的计算形式为2^-ΔCt，其中每一个取样时间点的ΔCt=（MT基因平均Ct值-18S rRNA基因平均Ct值），之后以0h对照组的2^-ΔCt值作为对照，取样时间点6h、12h、24h、48h、72h、96h对应的的2^-ΔCt值与其比较，分析hsp70基因相对表达量的上调情况，当hsp70基因的最高上调表达量与0h对照组相比存在显著差异时，即差异分析中的P值<0.05记为*，那么定义污水水样存在较为严重的生 态毒理危害，即水体污染较为严重，当hsp70基因的最高上调表达量与0h对照组相比存在极显著差异时，即差异分析中的P值<0.01，记为**，那么定义污水水样存在极为严重的生态毒理危害，即污染非常严重。 

3.根据权利要求1所述的一种生物学评价受污染水体质量的方法，其特征在于，实时荧光定量PCR采用具体扩增程序的反应条件为：95℃预变性3min，之后为反复进行的循环阶段，每个循环设置为：95℃变性30s，60℃退火35s，并且从55℃-95℃按照每秒升高0.5℃的进度进行荧光数值读取，获得反应过程对应的溶解曲线。 

4.根据权利要求1所述的一种生物学评价受污染水体质量的方法，其特征在于，利用T检验的数据分析方法分析取样时间点6h、12h、24h、48h、72h、96h对应的2^-ΔCt值与0h对照组对应的2^-ΔCt值之间显著性差异的p值，来定性评价克氏原螯虾hsp70基因的表达模式与水样污染程度之间的关系。