[发明专利]一种应用SSR分子标记技术鉴定商品卷烟的方法

说明书

技术领域：

本发明属于分子生物学技术领域，具体地说，本发明涉及应用一种分子生物学技术方法进行商品卷烟的鉴定。同时，本发明还涉及所述方法对单品种烟叶和混合烟丝样品的鉴定。

背景技术：

烟草作为人类最重要的经济作物之一，其遗传学特征一直都是研究的热点，目前，烟草的基因组全序列图谱已完成，这使人们能够从基因组的层面上更深入地对烟草进行研究。其中，关于烟草品种的遗传多样性研究不在少数，但从叶组配方和商品烟的角度研究还未见报道。原料品质的稳定和杜绝假冒伪劣产品是卷烟品牌生命力的重要保障。分子生物学技术在目前来说是最精确的品种鉴定手段，将其应用到商品卷烟真伪和原料品种的鉴定中，可更精确地了解原料组成，达到防伪的目的。

DNA简单重复序列（SSR）也称为微卫星DNA，是真核生物基因组中广泛分布的短串联DNA序列，由串联重复的核心序列和两侧较保守的侧翼序列构成。通常每个重复单位仅1～8个碱基，重复数为10～20次。在特定位点上按孟得尔方式分离的微卫星DNA提供了变异丰富、选择中性、共显性的分子标记，可用于植物种间、种内居群间以及个体间的多态性分析，在遗传作图、群体遗传研究、个体间亲缘关系以及品种鉴定等方面得到了广泛应用。成品烟丝由于生产和加工过程中DNA降解较为严重，通常可提取的DNA长度较短，因此限制了对于DNA质量要求较高的遗传标记技术（如AFLP等）的应用。而SSR标记目标DNA片段长度通常在100-400bp，因此，SSR技术为DNA质量较差的植物产品的分子鉴定提供了可能。对不同烟草品种进行遗传图谱分析，建立烟草品种DNA指纹，筛选品种特异性SSR多态性变异式样，通过比对成品烟丝SSR多态性特征，可能对成品烟原料品种及其来源进行鉴定。并且，SSR技术识别灵敏度高，可鉴别出混合样品中含量较少的目标样品。以往商品卷烟真伪判定依据产品商标、包装和抽吸感官，而采用分子生物学的方法根据卷烟原料品种进行鉴定目前还未有报道。

发明内容：

本发明根据烟草全基因组序列设计烟草SSR引物，用所设计的引物对单品种的烟草DNA进行扩增，筛选有品种特异性的位点。提取需要检测的商品卷烟烟丝或混合品种烟丝的总DNA，用筛选出的具有品种特异性的引物对其进行扩增，根据扩增所得的片段判断样品中品种的组成，从而鉴定商品卷烟或混合烟丝的真伪。此方法可直观从电泳图谱上进行烟草品种的鉴定，鉴别结果准确可靠，灵敏度高，具有较好的应用前景，丰富了卷烟鉴定的手段。

基于上述认识，本发明的目的在于提供一种直观、准确的鉴定商品卷烟或混合烟丝样品的方法。

本发明的目的是通过下述技术方案予以实现的：

一种应用SSR分子标记技术鉴定商品卷烟的方法，将SSR分子标记技术应用于商品卷烟的鉴定中，通过识别单品种或混合品种的特征条带，掌握所鉴定样品的原料品种组成，达到辨别真伪的目的，方法如下：

（1）从烟草基因组序列中随机选择具有SSR序列的区间设计引物，目标片段长度在110－250bp；

（2）提取单品种烟草DNA；

（3）品种特异性引物的筛选，将所设计的全部SSR引物在所收集的烟草单品种样品中进行扩增，筛选多态性仅存在于品种间的具有品种特异性的SSR标记；

（4）鉴定，提取需要鉴定样品的总DNA，用筛选出的品种特异性引物进行扩增，根据电泳图谱显示的品种特异性条带，判断样品中品种组成，通过与正品配方进行对比，鉴定卷烟真伪。

所述的方法适用的鉴定范围为单品种烟叶、叶组丝及混合品种烟丝。

品种特异性引物的设计和筛选采用：

（1）SSR多态性引物设计

从烟草基因组序列中随机选择具有SSR序列的区间设计引物。从GENBANK数据库中下载烟草全基因组序列，通过SSR Hunter软件搜索包含SSR位点的序列，通过Oligo6.0在其两侧设计引物，目标片段长度在110－250bp。

（2）单品种烟草DNA提取