[发明专利]导入hTERT重组子构建巨核细胞模型及其细胞库

说明书

技术领域

本发明涉及导入hTERT(端粒酶逆转录酶催化亚基)重组子或hTERT介导构建巨核细胞模型及其细胞库，主要用于血液病研究领域，为开展巨核细胞或与巨核细胞相关的各种研究提供细胞模型并保存其科研资源。

背景技术

巨核细胞是正常骨髓中的一种能生成血小板的成熟细胞。该细胞体积巨大，成熟的巨核细胞边缘部分破裂脱落后形成血小板。巨核细胞按发育过程分为(1)原始巨核细胞：胞体较大，直径15～30μm，圆形或不规则形。胞核较大，圆形，不规则，核染色质呈粗大网状，排列紧密，核仁2～3个。胞质量较少，不均匀，边缘不规则，染深蓝色，无颗粒，核周着色浅淡。(2)幼稚巨核细胞：胞体明显增大，直径30～50μm，外形常不规则。胞核不规则，有重叠或扭转，核染色质呈粗颗粒状或小块状，排列紧密，核仁可有可无，胞质量增多，染蓝色或浅蓝色，近核处呈淡蓝色或浅粉红色，出现少量天青胺蓝颗粒。(3)颗粒型巨核细胞：胞体甚大，直径40～70μm，有时可达100μm，其形态不规则。胞核较大，形态不规则，核染色质较粗糙，排列紧密呈团块状，无核仁，胞质极丰富，染粉红色，夹杂有蓝色，质内含有大量细小的紫红色颗粒，常聚集成簇，但无血小板形成。(4)产生血小板型巨核细胞：胞体巨大，直径40～70μm，有时可达100μm，胞核不规则，高度分叶状，核染色质呈团块状。胞质呈均匀粉红色，质内充满大小不等的紫红色颗粒或血小板。胞膜不清晰，多呈伪足状，其内侧及外侧常有血小板的堆集。(5)裸核型巨核细胞：产生血小板型巨核细胞的胞浆解体后，释放出大量血小板，仅剩一胞核，称之为裸核。

巨核细胞虽然在骨髓的造血细胞中为数最少，仅占骨髓有核细胞总数的0.05％，但其产生的血小板却对机体的止血功能极为重要。每个巨核细胞均可产生1000-6000个血小板。产血小板的巨核细胞也是从骨髓中的造血干细胞分化发展而来的。造血干细胞首先分化生成巨核系祖细胞，也称巨核系集落形成单位(colony forming unit-megakaryocyte，CFU-Meg)。祖细胞阶段的细胞核内的染色体一般是2-3倍体。当祖细胞是2倍体或4倍体时，细胞具有增殖能力，因此这是巨核细胞系增加细胞数量的阶段。当巨核系祖细胞进一步分化为8-32倍体的巨核细胞时，胞质开始分化，内膜系统逐渐完备。最后有一种膜性物质把巨核细胞的胞质分隔成许多小区。当每个小区被完全隔开时即成为血小板，一个个血小板通过静脉窦窦壁内皮间的空隙从巨核细胞脱落，进入血流。

据目前的研究所知，巨核细胞增殖、分化的调节机制类似于红细胞系生成的调节，至少受两种调节因子分别对两个分化阶段进行调节。这两种调节因子是：巨核系集落刺激因子(Meg-CSF)和促血小板生成素(thrombopoietin，TPO)。巨核系集落刺激因子是主要作用于祖细胞阶段的调节因子，它的作用是调节巨核系祖细胞的增殖。骨髓中巨核细胞总数减少时促使该调节因子的生成增加，Meg-CSF是一种低分子糖蛋白，分子量约为46000，它与促血小板生成素具有完全不同的免疫学性质。促血小板生成素也是一种糖蛋白，当血流中血小板减少时，促血小板生成素在血液中的浓度即增加。该调节因子的作用包括：①增强祖细胞的DNA合成和增加细胞多倍体的倍数；②刺激巨核细胞合成蛋白质；③增加巨核细胞的总数，结果增加了血小板的生成。根据去肾大鼠出现血小板减少时血液中促血小板生成素的浓度不增加的事实，推测肾可能是产生促血小板生成素的部位。

在某些不明原因或不明原因致上述调节紊乱的情况下，巨核细胞可出现(1)巨核细胞病态造血：如胞体、胞浆、胞核变小或畸型，功能障碍。(2)巨核细胞白血病：巨核细胞大量增殖而引起的恶性疾病。(3)巨核细胞成熟障碍：表现为外周血小板减少，骨髓巨核细胞成熟受阻。

为了在体外从细胞水平更进一步研究巨核细胞的发育、功能、病理机制或影响因素，就需要有一种可在体外长期传代培养的永生巨核细胞模型，但现在还没有这种巨核细胞模型。

国外文献报道，猴肾病毒40(SV40)可以使某些人类细胞发生永生化。Poulin DL、Kung AL 和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的导入能加快转化细胞的生长速率，永生化细胞在体外多次传代后，仍具有相对稳定的增殖特性和功能状态，同时也能保留其原始细胞的许多分化表型，可以用于转基因动物模型及人类和动物某些种类的细胞模型的建立，据此可以借助于研究转基因永生化细胞及动物模型而在体外研究原始细胞的特性，从而研究其发病机制。