[发明专利]SV40LT重组构建染色体缺失猫叫综合征细胞模型及其细胞库

权利要求书

1.一种用于医学研究领域的SV40LT重组构建染色体缺失猫叫综合征细胞模型及其细胞库，其主要特征是按常规以T4DNA连接酶、BamHI、pcDNA3.1(-)DNA及SV40LTag DNA构建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重组子、以感受态大肠杆菌纯化重组子、以脂质体转染法将其导入经胶原酶II消化的离体传代或呈对数生长的染色体缺失猫叫综合征组织细胞，使重组子与细胞的DNA整合，并扩大培养经G418筛选含阳性重组子的细胞克隆，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、软琼脂集落生长、裸鼠致瘤试验、转染细胞DNA中SV40大T基因检测、mRNA表达产物测定及DNA序列测定结果符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40LT抗原基因介导染色体缺失猫叫综合征体外研究细胞模型冻存于液氮中，为在体外从细胞水平(替代人体或动物直接试验)长期研究染色体缺失猫叫综合征的发病机制奠定基础。

2.根据权利要求1所述的SV40LT重组构建染色体缺失猫叫综合征细胞模型及其细胞库，其特征是所述细胞模型为(1)细胞在倒置光学显微镜下呈梭形或小园形的上皮细胞样贴壁生长；(2)细胞的生长曲线如以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴，在hepato ZYME-SFM无血清培养基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(3)染色体核型为“46，XX(XY)，5P^-”，即染色体数目为46条(二倍体)，并具有5号染色体短臂缺失；(4)细胞不能在软琼脂内生长(形成克隆)；(5)细胞为非恶化细胞，裸鼠致瘤试验阴性；(6)细胞的DNA中整合了SV40T抗原基因，表达SV40T抗原mRNA产物；(7)细胞传代至第65代、培养至第11天时，呈对数生长、圆形、梭形、铺满瓶底，其细胞生长汇合率达85％以上，此后随着传代次数的增加，细胞生长变慢、变稀疏；(8)作为细胞模型用于在体外从细胞水平研究染色体缺失猫叫综合征的发病机制、遗传资源贮存、实验对照及质控细胞。

3.根据权利要求1所述的SV40LT重组构建染色体缺失猫叫综合征细胞模型及其细胞库，其特征是取自因其他实验所需而采集的、并在其他实验后多余、废弃的染色体缺失猫叫综合征患儿羊水脱落组织细胞构建之。

4.根据权利要求1所述的SV40LT重组构建染色体缺失猫叫综合征细胞模型及其细胞库，其特征是所用的培养液为含有20％胎牛血清、5～10nmol/L胰岛素的RPMI1640或含有20mL/L胎牛血清、5～10nmol/L胰岛素的低糖DMEM培养液。

5.根据权利要求1所述的SV40LT重组构建染色体缺失猫叫综合征细胞模型及其细胞库，其特征是用作传代培养以备脂质体转染法导入重组子的染色体缺失猫叫综合征组织细胞，在原代扩增培养中，其收集指标是细胞贴壁培养约3～4天、细胞形态为梭形、小园形细胞不到10％、贴壁细胞的汇合率达75％～85％、处于刚进入对数生长期时收集细胞；用作脂质体转染法导入重组子的传代染色体缺失猫叫综合征组织细胞，其时机选择的指标是细胞形态为梭形、尚未见或仅见少于10％小园形细胞、贴壁细胞的汇合率达55％～65％、处于将进入或刚进入对数生长期时的培养细胞；传代细胞系收集的指标是选择细胞贴壁生长的汇合率达80～85％、处于对数生长期的前期时收集细胞；染色体核型分析的细胞收集指标是细胞生长密度达85-95％、小园形细胞占10％以上、处于对数生长期的细胞。

6.根据权利要求1所述的SV40LT重组构建染色体缺失猫叫综合征细胞模型及其细胞库，其特征是以0.01％胶原酶II消化贴壁生长的染色体缺失猫叫综合征组织细胞，作染色体核型分析时，每5mL培养液中加入250ug/ml秋水仙素100ul，混匀后置37℃培养箱4小时。

7.根据权利要求1所述的SV40LT重组构建染色体缺失猫叫综合征细胞模型及其细胞库，其特征是细胞库的构建包括(1)筛选经鉴定后符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近的SV40LT重组构建的染色体缺失猫叫综合征细胞；(2)作传代、扩大培养，取生长状态良好、处于对数生长期的不同世代的贴壁细胞；(3)经消化、终止、离心(1200r/min，6min)步骤收获细胞；(4)用含二甲亚砜的冻存液配制密度为5×10⁵个/ml的细胞悬液；(5)按照4℃，0.5h；-20℃，2h；-70℃，过夜；入-196℃液氮的程序冻存细胞；(6)可再生性地长期保存SV40LT重组构建的染色体缺失猫叫综合征细胞模型，备作遗传资源和科研材料。