[发明专利]SV40基因重组构建巨核细胞模型及其细胞库

权利要求书

1.一种用于医学研究领域的SV40基因重组构建巨核细胞模型及其细胞库，其主要特征是按常规以T4DNA连接酶、BamHI、pcDNA3.1(-)DNA及SV40LTag DNA构建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重组子、以感受态大肠杆菌纯化重组子、以脂质体转染法将其导入体外培养的巨核细胞，使重组子与细胞的DNA整合，以G418筛选的含阳性重组子的细胞，作传代、扩大培养，筛选细胞形态、细胞生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞DNA中SV40大T基因检测、mRNA表达产物测定及DNA序列测定结果符合永生化细胞生物学特性者作为巨核细胞模型冻存于液氮中，以此构建SV40LT基因介导巨核细胞模型及其细胞库，以建立在体外长期传代培养巨核细胞的方法并用于体外(替代人体或动物直接试验)研究巨核细胞发育、功能和病理机制。 

2.根据权利要求1所述的SV40基因重组构建巨核细胞模型及其细胞库，其特征是所指细胞模型为(1)巨核细胞转染了SV40LT基因而成为可长期传代培养的永生化巨核细胞模型；(2)巨核细胞模型的染色体核型为二倍体“46，XX”或“46，XY”；(3)巨核细胞模型的生长曲线如以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴，在hepato ZYME-SFM无血清培养基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(4)巨核细胞模型不能在软琼脂内生长(形成克隆)；(5)为非恶化细胞，裸鼠致瘤试验阴性；(6)因巨核细胞模型的DNA中整合了SV40大T抗原基因，所以表达SV40大T抗原mRNA产物；(7)体外连续培养7-8周(第60代)仍处于对数生长期；(8)能反复冻存、长期传代培养；(9)用于研究巨核细胞的功能；(10)可再生性地保存巨核细胞相关的遗传资源。 

3.根据权利要求1所述的SV40基因重组构建巨核细胞模型及其细胞库，其特征是原代巨核细胞取自因其他实验所需而采集的、并在其他实验后剩余、废弃的含有巨核细胞的标本。(8)能反复冻存、长期传代培养； 

4.根据权利要求1所述的SV40基因重组构建巨核细胞模型及其细胞库，其特征是所用的培养液为含有25％胎牛血清、5～10nmol／L胰岛素的RPMI1640或含有25％胎牛血清、5～ 10nmol／L胰岛素的低糖DMEM培养液，转染时胎牛血清浓度为20ml／L。 

5.根据权利要求1所述的SV40基因重组构建巨核细胞模型及其细胞库，其特征是用作脂质体转染法导入重组子的巨核细胞，处于预培养后1-2天。 

6.根据权利要求1所述的SV40基因重组构建巨核细胞模型及其细胞库，其特征是作染色体核型分析时，每5mL培养液中加入250ug／ml秋水仙素100ul，混匀后置37℃培养箱4小时。 

7.根据权利要求1所述的SV40基因重组构建巨核细胞模型及其细胞库，其特征是细胞库的构建包括(1)筛选经鉴定后符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近的SV40LT介导的巨核细胞；(2)作传代、扩大培养，取生长状态良好、处于对数生长期的不同世代的贴壁细胞；(3)经消化、终止、离心(1200r／min，6min)步骤收获细胞；(4)用含二甲亚砜的冻存液配制密度为5×10⁵个／ml的细胞悬液；(5)按照4℃，0.5h；-20℃，2h；-70℃，过夜；入-196℃液氮的程序冻存细胞；(6)可再生性地长期保存SV40LT介导巨核细胞模型，备作遗传资源和科研材料。