[发明专利]组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理卵母细胞的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物技术领域，尤其是涉及一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理卵母细胞的方法及其应用。

背景技术

目前，人们已在不同物种中利用体细胞克隆技术生产出了克隆动物。但是，克隆动物出生率低，后代发育异常制约着该项技术的广泛应用。随着研究的不断深入，体细胞核在受体胞质中的不完全重编程或重编程异常是导致克隆胚胎发育异常的重要原因。正常受精及胚胎发育过程中，DNA修饰经历甲基化的去除和重建，组蛋白的修饰也经历动态变化。然而，在克隆胚胎的早期发育过程中则存在异常高DNA水平，以及异常的组蛋白修饰。

组蛋白氨基酸残基的修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化、苏素化、ADP核糖基化、脯氨酸异构化等，这些修饰导致染色体构象的改变，从而调控基因的表达、沉默。组蛋白赖氨酸乙酰化、甲基化在基因表达调控及染色体构象变化中起重要作用。组蛋白乙酰化修饰受乙酰化转移酶、去乙酰化酶(HDAC)的调节，去乙酰化酶活性的抑制，导致细胞组蛋白乙酰化明显增加，激活沉默的基因表达。

TSA是一种可逆的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。TSA处理牛供体细胞可显著增加体细胞的组蛋白乙酰化水平，但是没有促进克隆胚胎的发育和重编程。当使用该药物处理早期克隆胚胎时，明显改善了牛克隆胚胎的体外发育。但是，是否促进了正常重编程的发生还不清楚。然而，目前还未见到相关该药物处理牛卵母细胞对牛克隆胚胎和重编程影响的报道。

卵母细胞成熟过程需要多种酶的周期调控，并且进入卵母细胞中的体细胞核也同样受到卵母细胞内酶类的调控。因此，卵母细胞的胞质环境在调控体细胞核表观遗传重编程方面起着更为关键的作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理卵母细胞的方法及其应用；通过使用TSA短期处理体外成熟培养的牛卵母细胞增加了体细胞核在卵母细胞质中的稳定性，使克隆胚胎激活前的组蛋白修饰与正常卵母细胞类似，并且显著的提高了牛体细胞克隆胚胎的体外发育率及胚胎质量。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理培养卵母细胞的方法，其特征是，所述卵母细胞的处理时期为生发泡期至第一次减数分裂后末期；所述处理时间为18小时；所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂的处理浓度为0.5-10ng/mL。

优选的，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂的处理浓度为1ng/mL。

优选的，其特征是，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为TSA，其中，TSA为Trichostatin A。

本发明还提供了组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理培养卵母细胞的方法在改善牛体细胞克隆胚胎制备技术中的应用。

采用了上述技术方案，本发明的有益效果为：本发明通过使用TSA短期处理体外成熟培养的牛卵母细胞增加了体细胞核在卵母细胞质中的稳定性，使克隆胚胎激活前的组蛋白修饰与正常卵母细胞类似，并且显著的提高了牛体细胞克隆胚胎的体外发育率及胚胎质量。

附图说明

附图1不同来源重构胚融合2hr后不同组蛋白乙酰化修饰位点的免疫细胞化学染色的动态变化研究；

附图2体外成熟牛卵母细胞MII期不同组蛋白乙酰化修饰位点的免疫细胞化学染色；

附图3TSA处理卵母细胞对激活前重构胚染色质稳定性的影响；

附图4TSA处理卵母细胞激活前重构胚正常核型率统计。

其中，附图1中，A、A’-G、G’：未处理重构胚融合2hr后H3K9ac、H3K18ac、H4K8ac和H4K5ac免疫染色；B、B’-H、H’：卵母细胞处理组后的重构胚融合2hr后H3K9ac、H3K18ac、H4K8ac和H4K5ac免疫染色。标尺所示为50μm。

附图2中，A、A’、A”-D、D’、D”：体外成熟牛卵母细胞MII期H3K9ac、H3K18ac、H4K8ac和H4K5ac免疫染色。

附图3中，A、A’，B、B’为未处理组供体细胞染色体。A、A’：融合2hr(F2h)；B、B’：融合4hr(F4h)。C、C’，D、D’为1ng/mL TSA处理组。C、C’：融合2hr(F2h)；D、D’：融合4hr(F4h)；A、B、C、D：DNA；A’、B’、C’、D’：DNA+Tubulin。标尺所示为50μm。

附图4中，字母不同表示组间存在显著性差异(P＜0.01)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

如附图1-4所示，