[发明专利]一种副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗组合物及应用

说明书

技术领域

本发明涉及动物传染病亚单位疫苗制备技术领域。具体涉及一种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原组合物及其制备方法和应用，所述组合物包含七种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原。

背景技术

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，Hps）是一种革兰氏阴性菌，常定居于猪的上呼吸道，是一种条件致病菌，能够导致猪的副猪嗜血杆菌病。在1910年首次报道该菌，因此该病又称为革拉瑟氏病（disease）。Hps只感染猪，能够影响2周龄到4月龄的猪，发病常见于5～8周龄猪。发病率为10%～15%，严重时死亡率可达50%，给养猪业带来巨大损失，该病的主要特征为纤维素性胸膜炎、腹膜炎、关节炎、心包炎和脑膜炎。

蛋白质组学是一个旨在大规模、高通量、高效率地分离和鉴定构成生物体的蛋白质及其功能的新研究领域。因此蛋白质组学技术非常适用于免疫原及疫苗候选成分的筛选等方面的研究。疫苗是生物体抵抗病原微生物的有利武器，而具有保护作用的免疫原往往是理想的疫苗候选靶位。但传统研究方法存在低效、费时及不经济等诸多不利原因，使高效疫苗靶位的发现受到了一定程度限制。在这种情形下，免疫蛋白质组学(Immunoproteomic)随着蛋白质组学的出现也应运而生。免疫蛋白质组学将蛋白质组学技术鉴定蛋白质的高通量性与免疫学技术鉴定免疫原的可靠性有机地结合起来，在病原微生物、肿瘤免疫原和疫苗候选靶位的研究中占据着重要的地位，已经成为该研究领域中最具生命力的技术手段。

免疫蛋白质组学技术是一种有力的工具用于系统的鉴定病原的免疫原性蛋白，研究者们已经应用这项技术成功的从猪链球菌、炭疽芽苞杆菌、福氏志贺菌的亚组份结构中发现了新型抗原，如外膜蛋白。对于G^-病原菌而言，分泌蛋白和外膜蛋白直接参与病原菌在宿主体内的定植、粘附、侵入过程，因此在细菌的感染过程中，分泌和外膜蛋白直接与宿主的免疫系统相互作用，发挥重要的功能。所以从G^-菌的这些亚细胞组份中筛选重要的疫苗候选抗原是可行的。

本研究通过克隆、表达七种编码具有免疫蛋白的基因，并将纯化后的蛋白混合后免疫小鼠，发现其对小鼠感染副猪嗜血杆菌能提供有效的免疫保护力，可以作为副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗开发的候选抗原。

发明内容

本发明的目的是提供能够用于制备副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗的候选抗原的蛋白及其编码基因。

本研究通过双向电泳和蛋白印迹法技术对副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，Hps)分泌蛋白质组进行分析，筛选出抗原性好、保护力强的抗原蛋白，以期为发展血清学诊断标记及新型亚单位疫苗的研发奠定坚实的基础。

本发明鉴定到具有免疫保护效果的七种蛋白，其混合物对小鼠感染副猪嗜血杆菌能提供有效的免疫保护力，可以作为副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗开发的候选抗原。

为了实现本发明目的，本发明首先分离副猪嗜血杆菌的胞外分泌蛋白，然后通过双向电泳方法分离分泌蛋白质组，并将其转移至硝酸纤维素膜上，使用猪的康复血清进行western-blot杂交寻找具有免疫原性的蛋白，然后通过质谱鉴定技术对具有免疫原性的蛋白进行质谱鉴定，再对其编码基因进行克隆表达，将表达的蛋白纯化后，再进行免疫原性分析，同时将七种蛋白混合后进行小鼠的免疫保护试验，结果表明其具有一定的免疫保护作用。

本发明同时保护一种制备七种蛋白的方法，所述方法包括培养含有蛋白编码序列的重组大肠杆菌，得到重组蛋白。所述制备重组蛋白的方法具体可为：将所述重组菌37℃培养3h，OD₆₀₀＝0.7时，加入IPTG至终浓度0.8μM，转至37℃继续培养4h。

本发明的重组蛋白具有免疫保护活性。

本发明的重组蛋白混合物可以应用于副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗的制备。

更具体地，本发明提供以下各项：

附图说明

图1：左图为分泌蛋白的双向电泳分离图谱；右图为转膜后杂交图。

图2：七种蛋白转膜后杂交图。

图3-1：七种蛋白不同浓度混合免疫攻毒后小鼠存活率图。

图3-2：七种蛋白单独及100μg混合免疫攻毒后小鼠存活率图。

具体实施方式