[发明专利]一种用家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达EGF—TCSKDEL融合蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达EGF—TCSKDEL融合蛋白的方法，尤其涉及一种用家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达EGF—TCSKDEL融合蛋白的方法。 

背景技术

目前，应用于临床肿瘤治疗的蛋白药物主要有干扰素、白介素等，尽管在临床上已成功的治疗了某些特定来源的肿瘤，但从总体上来说临床疗效一般，同时也产生了严重的毒副作用和剂量依赖性等，且只有部分病人对治疗敏感。因此有必要研究具有更好临床疗效和较小副作用的蛋白药物。 

人表皮生长因子(human epidemal growth factor，EGF)是一种通过受体起作用刺激细胞增殖和分化的重要生长因子，很多恶性肿瘤如肾癌、胃癌、前列腺癌、肝癌、非小细胞肺癌、膀胱癌等均过度表达EGF受体。EGF可竞争结合癌细胞表面受体，携带毒素特异地杀伤癌细胞。天花粉蛋白(TrichosantIlin，TCS)是一种自然存在的植物单链毒素，具有抑制肿瘤生长的作用。KDEL则是一段高疏水的序列，将其应用于TCS的末端可以提高TCS的活性，利用EGF的靶向性和TCSKDEL蛋白的细胞毒性构建的EGF—TCSKDEL融合蛋白，能够靶向性杀伤肿瘤细胞，有利于临床肿瘤的治疗。体外实验和移植实体瘤整体动物实验研究表明，该融合蛋白具有明显的靶向抗肿瘤效果。 

家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统由供体质粒、含有家蚕杆状病毒Bacmid基因组的感受态细菌DH10BmBac构成，其产生重组病毒的原理是：首先将外源目的基因克隆入供体质粒中，然后将供体质粒转化入DH10BmBac感受态细胞中，通过细菌转座子的定点转位作用，将启动子和目的基因一起转入家蚕杆状病毒基因组而产生重组病毒DNA，再通过转染家蚕细胞而获得含有目的基因的重组杆状病毒。我们利用该系统快速产生能够表达EGF—TCSKDEL融合蛋白的重组病毒，并利用家蚕BmN细胞表达出具有活性的EGF—TCSKDEL融合蛋白，为利用家蚕生物反应器生产该融合蛋白打下基础。 

发明内容

发明目的：为了解决现有技术所存在的问题，本发明提供了一种具有较高表达量和生物活性的用家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达EGF—TCSKDEL融合蛋白的方法。 

技术方案：为达到上述目的，本发明一种用家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达EGF—TCSKDEL融合蛋白的方法，包括以下步骤： 

（1）将EGF—TCSKDEL基因从质粒pET28a-EGF—TCSKDEL中亚克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTb的多克隆位点中，使目的基因位于杆状病毒多角体启动子的下游； 

（2）将该质粒转化入含有家蚕杆状病毒Bacmid基因组的感受态细菌DH10BmBac细胞内，在含有抗生素和半乳糖苷类似物X-Gal的培养板上过夜培养； 

（3）通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，随后从阳性克隆中抽提质粒DNA，该质粒DNA即为重组病毒的基因组； 

（4）用此DNA转染家蚕细胞BmN，72h后分离培养基上清液，获得含有EGF—TCSKDEL基因的重组杆状病毒； 

（5）利用Ni－NTA柱从感染重组杆状病毒的家蚕细胞中分离纯化重组EGF—TCSKDEL融合蛋白：用收集到的重组杆状病毒大量感染BmN细胞，观察到细胞有感染迹象时，收集细胞，将细胞经超声破碎后离心取上清，将上清液利用Ni－NTA柱分离纯化获得相应的目的蛋白质，并通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白纯度。 

更为优选的，所述步骤（1）中多克隆位点为BamHI和HindIII。 

更进一步的，所述步骤（2）中抗生素为卡那霉素和庆大霉素中的一种或多种。 

更进一步的，所述卡那霉素的浓度为50μg/mL。 

更进一步的，所述庆大霉素的浓度为30μg/mL。 

更进一步的，所述半乳糖苷类似物X-Gal的浓度为40μg/mL。