[发明专利]一种荞麦过敏原成分环介导等温扩增检测试剂盒和使用方法

权利要求书

1.一种荞麦过敏原成分环介导等温扩增检测试剂盒  ，其特征在于包括：

（1）LAMP扩增反应液A

包括：10×ThermolPol缓冲液，50mmol/L硫酸镁溶液，5mol/L甜菜碱，dNTPs溶液（每种核苷酸浓度10 mmol/L），8U/μL Bst DNA聚合酶， 0.2-0.6μmol/L外侧上下游引物，0.2-0.6μmol/L内侧上下游引物；

所述外侧上游引物（F3）序列为： 5’- ATCCTCGGACCGAGATGG -3’，外侧下游引物（B3）序列为： 5’-AGTCCTTCTCTTCCTGCCT-3’， 内侧上游引物（FIP）序列为：5’-CTCCGACAACCTGGACTCTTCCAACTTGAACGCGCACAGC -3’，内侧下游引物（BIP）序列为5’-AGTGTGTTCGACGACAACGTGCTCAACACCACTGCGAATCC -3’；

（2）显色液：SYBR Green I 荧光染料或DNAGreen，1000 ×。

2.根据权利要求1 所述的荞麦过敏原成分环介导等温扩增检测试剂盒  ，其特征在于所述10×ThermolPol缓冲液含有200 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）、100 mmol/L硫酸铵、100 mmol/L 氯化钾、20 mmol/L硫酸镁、1% Triton X-100。

3.根据权利要求1中所述的荞麦过敏原成分环介导等温扩增检测试剂盒 ，其特征在于所述dNTP四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP：dATP：dGTP：dCTP=2:1:1:1。

4.根据权利要求1中所述的一种荞麦过敏原成分环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于所述LAMP扩增反应液A每管23ul，组成为： 2.5ul 10 ×ThermoPol缓冲液，1.0ul 5 μmol/L外侧上游引物（F3），1.0ul 5 μmol/L外侧下游引物（B3），1.0    ul 40 μmol/L内侧上游引物（FIP），1.0ul 40 μmol/L内侧下游引物（BIP），5.0ul 10 mmol/L  dNTPs      ，4ul 5 mol/L甜菜碱 ，0.5ul 100 mmol/L硫酸镁溶液(包括缓冲液中所含硫酸镁)，1ul 8 U/μL Bst DNA聚合酶，2ul 10 ng/μL DNA模板和6ul双蒸水。

5.一种荞麦过敏原成分环介导等温扩增检测试剂盒的使用方法，其特征在于包括下列步骤：

（1）待检样品DNA的提取

A.称取300 mg经预处理的样品于2 mL离心管中，加入600 μL CTAB缓冲液和40 μL蛋白酶K，振荡混匀，65℃温浴30 min～90 min，期间每隔10 min 轻柔颠倒混匀；

B. 2 000g离心5 min，取上清于另一干净的2 mL离心管中，加入等体积的酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液（25：24：1），震荡混匀； 

C. 12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀；

D. 12 000 g离心10 min，弃去上清液，用预热至65℃ 的TE缓冲液溶解DNA；

E. 加入5 μL RNA酶溶液，37 ℃ 30 min ；

F. 加入200 μL三氯甲烷：异戊醇（24：1），强烈振荡；

G. 12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀；

H. 12 000 g离心10 min，弃去上清液，用4℃预冷的70%乙醇500 μL，涡旋清洗沉淀；

I. 12 000 g离心10 min，弃去上清液，倒置晾干后加100 μL TE缓冲液溶解沉淀，即为待检样品模板DNA；

（2）进行荞麦过敏原成分的环介导等温扩增反应

A：在装有23uL  LAMP反应液A的反应管中加入2ul待检样品模板DNA；

B：65 ℃恒温扩增60 min，80 ℃ 5 min使酶灭活，反应结束；

（3）显色检测

反应结束后，在待检的每个反应管中加入1ul显色液，将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，在黑色背景下立即进行颜色观察，如果颜色为黄色，说明待检样品不含有荞麦过敏原成分，如果颜色变为绿色，则说明待检样品含有荞麦过敏原成分。