[发明专利]导入hTERT和SV40LT重组子构建爱德华综合征细胞模型及其细胞库

说明书

技术领域

本发明涉及导入hTERT(端粒酶逆转录酶催化亚基)和SV40LT(猴肾病毒40大T抗原基因)重组子(SV40LT和hTERT介导)构建爱德华综合征细胞模型及其细胞库，主要用于生殖健康研究领域，为爱德华综合症的体外研究提供细胞模型并保存其科研资源。

背景技术

爱德华综合症，亦名18-三体症，即患者多了一条18号染色体。该综合征主要症状表现为患者头有后凸的枕部、眼裂狭小、耳朵畸形、耳位低下、小颌、胸骨短小等。由于患儿存在严重的智力低下伴多发畸形，50％在出生后2个月内死亡，可活至1年的不到10％，极个别可活到15岁。因缺乏有效的治疗手段，一旦患儿出生将会给家庭和社会带来极大的精神和经济负担，已严重影响我国的人口质量，已成为社会发展的沉重负担和可持续发展的严重障碍。

近年来，国内外将爱德华综合症列为三大重大出生缺陷之一，作为重点干预对象，并建立了相应的产前筛查和产前诊断方法。在《国民经济和社会发展的第十一个五年规划纲要》中强调，要加大爱德华综合症等出生缺陷的干预力度，以改善出生人口素质；在《国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020年)》中将爱德华综合症等出生缺陷的研究列为优先主题。

目前对爱德华综合症等出生缺陷的研究主要是针对遗传、生物、物理、化学因素与发病(率)的关系以及其早期筛查和诊断方面，如国外有大量的文献报道，18-三体等出生缺陷的发生与地区性、受孕时间、有害物接触史等环境因素呈显著相关；有国外文献报道，近亲婚配时所存在的两个相同隐性基因与生育爱德华综合症等出生缺陷患儿有关；Graaf、Rudnicka等报道孕妇的体重、吸烟习惯、孕产次与爱德华综合症筛查指标有关；另有国内学者报道孕妇吸烟、微量元素、心理因素、饮食、TORCH感染等与爱德华综合症等出生缺陷相关。

但是，由于没有理想的可在体外长期培养的、可用于发病机制研究的永生细胞模型及其细胞库，就难以从细胞水平(以体外生长的活细胞替代人体或动物直接试验)在体外动态、实时研究爱德华综合症受物理、化学、生物、遗传等影响的基因突变、基因表达、功能改变、生理特性、生物传导等机制，从而严重限制了爱德华综合症的进一步研究。

国外文献报道，猴肾病毒40(SV40)可以使某些人类细胞发生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sulli van CS等研究表明，SV40T抗原基因的导入能加快转化细胞的生长速率，永生化细胞在体外多次传代后，仍具有相对稳定的增殖特性和功能状态，同时也能保留其原始细胞的许多分化表型，可以用于转基因动物模型及人类和动物某些种类的细胞模型的建立，据此可以借助于研究转基因永生化细胞及动物模型而在体外研究原始细胞的特性，从而研究其发病机制。

但国外最近有研究发现，SV40Tag转染的细胞伴随着DNA损伤修复机制的丢失、核型的不稳定性以及少数细胞致瘤性转化。此外，长期体外培养发现部分转染SV40Tag的细胞只是延长了寿命，或仅仅渡过了衰老期(MI期)，多数细胞会最终进入危机期(M2期)而死亡，说明细胞并未获得永生化。同时SV40病毒具有致瘤性，与某些肿瘤的发生、发展有关，因此SV40Tag转染的细胞对某些研究也存在一定程度的限制性。

国外研究表明，导入外源性hTERT可以使细胞保持正常表型及分化特征。近年来已利用hTERT成功建立了某些细胞的永生化细胞系，基本保持染色体稳定、分化正常、接触抑制、无致瘤性等相对“正常”的生长特征。可以用于人类和动物某些种类的细胞模型的建立，对借助于研究转基因永生化细胞模型而研究原始细胞的特性，从而研究其发病机制，具有重要的意义。在口腔医学领域，日本学者Kamata、Fujita和Fujii转染hTERT建立了永生化人牙龈成纤维细胞、牙周细胞、牙髓细胞系和牙囊细胞系，细胞群体倍增数达150次以上，细胞均表现原有的生物学特性，诱导培养后都可以表达来源细胞的相关蛋白。Kitagawa等转染hTERT建立了人成牙骨质细胞系，细胞倍增达200次以上，细胞分化标志物如碱性磷酸酶、I型胶原等表达稳定。因研究工作的需要，几乎每种疾病都有各自的细胞模型。如糖尿病细胞模型、癌细胞细胞模型、转基因细胞模型、绝经期综合症细胞模型、子宫内膜细胞模型、癫痫细胞模型、电子细胞模型、酒精性痴呆细胞模型、脑水肿细胞模型。等等。