[发明专利]一种同时检测宫颈癌标志物的夹心型电化学免疫传感器

权利要求书

1.一种夹心型电化学免疫传感器，所述电化学免疫传感器包括：工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰rGO-TEPA孵化的一抗、牛血清蛋白、宫颈癌肿瘤标志物抗原和Au@CMK-3分别与中性红、硫堇孵化的二抗，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为铂丝电极；

其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

a、制备Au@CMK-3和电子媒介体孵化的二抗(Ab₂)溶液；

b、制备电化学免疫传感器工作电极；

c、制作电化学免疫传感器工作曲线；

其中，步骤a制备Au@CMK-3和电子媒介体孵化的二抗(Ab₂)溶液的具体步骤如下：

① Au@CMK-3的合成：含有0.01g氯金酸的100 mL溶液放入烧瓶中加热至沸腾，再逐滴加入1%的柠檬酸钠并保持此温度40 min，冷却至室温，向该溶液中加入介孔碳CMK-3搅拌4h，最后在9000 转速下离心20 min，离心三次，真空干燥制得到Au@ CMK-3；

② Au@CMK-3和电子媒介体孵化的二抗(Ab₂)溶液的制备：平行称取两份上述步骤①制备的Au@ CMK-3，加入pH为7.4 的PBS超声使其溶解后， 分别加入anti-CEA，anti-SCCA的EDC-NHS溶液，在4℃下孵化12 h，然后再分别对应加入2 mg/mL中性红溶液、2 mg/mL硫堇溶液溶液，并在4℃下孵化10 h，最后在6000 转速下离心20 min，洗涤后重新分散于pH为7.4的PBS中得到不同的二抗溶液；

③ 将步骤②制备的两份二抗溶液等体积混合得到Au@CMK-3-anti-CEA-中性红和Au@CMK-3-anti-SCCA-硫堇的二抗混合溶液；

步骤b制备电化学免疫传感器工作电极的具体步骤如下：

① 将玻碳电极表面进行抛光处理使其表面光洁；

② EDC和NHS (50 mmol/L) 加入到10 μg/mL SCCA或10 μg/mL CEA的一抗溶液中，然后再分别加入2 mg氨基化石墨烯，振荡4 h后离心，洗涤，用PBS稀释到原来的刻度，得到相应的rGO-TPEA -Ab₁溶液，最后将两份溶液进行等体积混合得到的一抗混合溶液滴到电极上，室温晾干； 

③ 再在电极表面修饰质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液(BSA) 以消除电极的非特异性活性位点，用pH为7.4的PBS对电极进行清洗，晾干后，依次滴上不同浓度的宫颈癌两种肿瘤标志物抗原溶液，将抗原和抗体在室温孵化30 min，保证一抗和抗原形成半免疫复合物；

④ 将制备好的Au@ CMK-3-anti-CEA-中性红和Au@ CMK-3-anti-SCCA-硫堇的二抗混合溶液修饰到电极上，在4 ℃保存晾干，即得到电化学免疫传感器的工作电极；

步骤c制作电化学免疫传感器工作曲线的具体步骤如下：

① 将参比电极—饱和甘汞电极、对电极—铂丝电极和上述制备的工作电极正确连接在电化学工作站上；

②  pH 7.4的PBS缓冲溶液(含0.1 mol/LKCl作为支持电解质)作为底液，通过差分脉冲伏安法（DPV）检测修饰好的工作电极对中性红（-0.62V）和硫堇（-0.17V）在不同电位下的响应；根据不同电子媒介体所得电流响应与其对应的不同肿瘤标志物抗原标准溶液浓度的关系，绘制工作曲线。

2.如权利要求1所述的制备方法制备的夹心型电化学免疫传感器在同时检测宫颈癌肿瘤标志物中的用途。

3.权利要求2所述的用途，其中，所述宫颈癌肿瘤标志物为SCCA和CEA。