[发明专利]重组SV40LT和hTERT基因构建21-三体综合征细胞模型及其细胞库

权利要求书

1.一种用于生殖遗传领域的重组SV40LT和hTERT基因构建21-三体综合征细胞模型及其细胞库的方法，其主要特征是以T4DNA连接经BamHI酶切质粒SV40LTag DNA及载体pcDNA3.1(-)DNA的产物，构建SV40LT-pcDNA3.1(-)重组子；并以Ligation Mix连接经EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo-hTERT和载体pLXSNneo的产物，构建pLXSNneo-hTERT重组子，两重组子经感受态细胞扩增纯化和鉴定后以脂质体转染导入21-三体综合征组织细胞，经G418筛选含阳性重组子的细胞克隆并扩大培养，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达产物、免疫组织化学染色、细胞增殖周期及细胞凋亡率符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40LT和hTERT基因重组构建的21-三体综合征体外研究细胞模型冻存于液氮中，为从细胞水平(替代人体或动物直接试验)在体外长期研究其发病机制奠定基础。

2.根据权利要求1所述的重组SV40LT和hTERT基因构建21-三体综合征细胞模型及其细胞库的方法，其特征是所指细胞模型为(1)细胞在倒置光学显微镜下呈梭形或小园形的上皮细胞样贴壁生长；(2)细胞的生长曲线如以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴，在hepato ZYME—SFM无血清培养基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(3)染色体核型为47，XX，+21；或47，XY，+21；或相同于本发明采集的原代21-三体综合征细胞；(4)细胞不能在软琼脂内生长(形成克隆)；(5)细胞为非恶化细胞，裸鼠致瘤试验阴性；(6)细胞的DNA中同时整合了SV40LT和hTERT基因，同时表达SV40LT和hTERT基因的mRNA产物；(7)细胞传代至第165代、培养至第9天时，呈对数生长、圆形、梭形、铺满瓶底，其细胞生长汇合率达90％以上，此后随着传代次数的增加，细胞生长变慢、变稀疏；(8)作为细胞模型用于体外从细胞水平研究21-三体综合征的发病机制、遗传资源贮存、实验对照及质控细胞。

3.根据权利要求1所述的SV40LT和hTERT介导21-三体综合征细胞模型及其细胞库的构建，其特征是取自因其他实验所需而采集的、并在其他实验后多余、废弃的21-三体综合征患儿羊水脱落细胞构建之。

4.根据权利要求1所述的SV40LT和hTERT介导21-三体综合征细胞模型及其细胞库的构建，其特征是所用的培养液为含有20％胎牛血清、5～10nmol／L胰岛素的RPMI1640或含有20mL／L胎牛血清、5～10nmol/L胰岛素的低糖DMEM培养液。

5.根据权利要求1所述的SV40LT和hTERT介导21-三体综合征细胞模型及其细胞库的构建，其特征是用作传代培养以备脂质体转染法导入重组子的21-三体综合征组织细胞，在原代扩增培养中，其收集指标是细胞贴壁培养约3～4天、细胞形态为梭形、小园形细胞不到10％、贴壁细胞的汇合率达75％～85％、处于刚进入对数生长期时收集细胞；用作脂质体转染法导入重组子的传代21-三体综合征组织细胞，其时机选择的指标是细胞形态为梭形、尚未见或仅见少于10％小园形细胞、贴壁细胞的汇合率达55％～65％、处于将进入或刚进入对数生长期时的培养细胞；传代细胞系收集的指标是选择细胞贴壁生长的汇合率达80～85％、处于对数生长期的前期时收集细胞；染色体核型分析的细胞收集指标是细胞生长密度达85-95％、小园形细胞占10％以上、处于对数生长期的细胞。

6.根据权利要求1所述的SV40LT和hTERT介导21-三体综合征细胞模型及其细胞库的构建，其特征是以0.01％胶原酶II消化贴壁生长的21-三体综合征组织细胞，作染色体核型分析时，每5mL培养液中加入250ug／ml秋水仙素100ul，混匀后置37℃培养箱4小时。

7.根据权利要求1所述的SV40LT和hTERT介导21-三体综合征细胞模型及其细胞库的构建，其特征是细胞库的构建包括(1)筛选经鉴定后符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近的SV40LT和hTERT基因重组构建的21-三体综合征细胞；(2)作传代、扩大培养，取生长状态良好、处于对数生长期的不同世代的贴壁细胞；(3)经消化、终止、离心(1200r／min，6min)步骤收获细胞；(4)用含二甲亚砜的冻存液配制密度为5×10⁵个／ml的细胞悬液；(5)按照4℃，0.5h；-20℃，2h；-70℃，过夜；入-196℃液氮的程序冻存细胞；(6)可再生性地长期保存SV40LT和hTERT基因重组构建的21-三体综合征细胞模型，备作遗传资源和科研材料。