[发明专利]一种低分子肝素部分降解产物的离子对反相色谱质谱联用检测方法

权利要求书

1.一种低分子肝素部分降解产物的离子对反相色谱质谱联用检测方法，步骤如下：

（1）将胺类离子对试剂溶解于去离子水，制得胺类离子对浓度为10～40mM的流动相A，并将pH调至5.5～8.5；

或者，将胺类离子对试剂及六氟异丙醇溶解于去离子水，制得胺类离子对浓度为10～40mM、六氟异丙醇浓度为20～100mM的流动相A’；

（2）将胺类离子对试剂溶解于体积百分比为75%的乙腈或体积百分比为75%的甲醇溶液中，制得胺类离子对浓度为10～40mM的流动相B，并将pH调至5.5～8.5；

或者，将胺类离子对试剂及六氟异丙醇溶解于体积百分比为75%的乙腈或体积百分比为75%甲醇溶液，制得胺类离子对浓度为10～40mM、六氟异丙醇浓度为20～100mM的流动相B’；

（3）将待测低分子肝素样品溶于流动相A或流动相A’，配制成浓度为6～10mg/mL的待测溶液，经过滤后，使用C₁₈反相色谱柱；流速8～12μL/min，洗脱梯度如下，均为体积百分比：

0～5min，95%流动相A，5%流动相B；5～60min，65～95%流动相A，5～35%流动相B，

或者，0～5min，95%流动相A’，5%流动相B’；5～60min，60～95%流动相A’，5～40%流动相B’；

（4）在正离子模式或负离子模式下用高分辨质谱仪进行检测，得到高分辨质谱图；

（5）通过紫外检测色谱图确定低分子肝素的种类，然后根据步骤（4）获得的高分辨质谱图获得主要峰的质荷比M，经如下公式计算组分的精确分子量m：

正离子模式：m=zM-nX-zY

负离子模式：m=zM-nX+zY

其中：z表示电荷数，n表示离子对试剂分子个数，X表示离子对试剂的分子量，Y表示质子氢的分子量；

（6）使用计算机辅助方法进行解谱，具体过程为：通过计算机生成各肝素组分的分子量数据库，用步骤（5）中得到的精确分子量与数据库中的理论分子量进行比对获得误差值Ⅰ，按误差值Ⅰ的大小对数据库中的数据进行排列，然后，根据质谱仪检测标准品的误差值Ⅱ与误差值Ⅰ进行比对，选取误差值Ⅱ与误差值Ⅰ最为接近的数据库中的理论样品，通过该理论样品的信息即可获知待测低分子肝素样品的结构信息。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中的胺类离子对试剂选自：正丙胺、三正丙胺、正戊胺、正丁胺或正己胺。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中的胺类离子对试剂选自：正丙胺、三正丙胺、正戊胺、正丁胺或正己胺。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（4）中的高分辨质谱采用离子阱时间飞行串联质谱仪（IT-TOF），设定参数为：正离子模式喷雾电压：+3.6kV；负离子模式喷雾电压：-3.0kV；喷雾气流速：0.5L/min或者1.5L/min；扫描质量范围：50～5000；如果采用四级杆时间飞行串联质谱仪（Q-TOF），设定参数为：正离子模式喷雾电压：+5.5kV；负离子模式喷雾电压：-4.0kV；帘气压25psi；喷雾气压：30psi；扫描质量范围：50～4000。