[发明专利]用于无抗生素ColE1 质粒增殖的宿主-载体系统

说明书

本发明涉及用于无抗生素ColE1质粒增殖的宿主‑载体系统。宿主‑载体系统，利用ColE1‑型质粒的基于RNA‑拷贝数控制机制用于调节标志物基因的表达，容许进行质粒的无抗生素筛选并且可以用于产生质粒DNA和重组蛋白。

本申请是申请日为2005年09月08日、中国申请号为200580037778.9、发明名称为“用于无抗生素ColE1质粒增殖的宿主-载体系统”的发明申请的分案申请。

本发明涉及质粒增殖领域，尤其是质粒DNA以及重组蛋白的产生。

利用质粒DNA作为基因转移工具已经广泛用于基因治疗领域。

在基因治疗应用中，将携带治疗性兴趣基因的质粒导入到患者中，靶细胞中该基因的短暂表达导致期望的治疗效果。

携带感兴趣的治疗基因的重组质粒可以通过培养细菌得到。为了筛选细菌转化株并且为了保证质粒在细菌宿主细胞中的保持，通常地，将抗生素抗性基因包括在质粒骨架中。质粒的筛选通过将细胞在包含各自抗生素的培养基中生长而实现，其中只有携带质粒的细胞能够生长。

利用抗生素抗性基因进行筛选质粒以用于基因治疗具有以下缺点：

由于在基因治疗中，完整的质粒被递送，抗生素抗性基因导入到治疗对象中。尽管这些基因被原核启动子所启动并且因此在哺乳动物细胞以及组织中没有活性，存在将递送的基因整合到细胞基因组中的可能性并且因此可能，如果在哺乳动物启动子附近，可能被转录并且表达。

携带抗生素抗性基因的质粒第二个缺点是可能被带有残留的抗生素最终的产物污染。考虑到可能的免疫致敏性，这是一个问题，尤其是利用β-内酰胺抗生素的情形下。

为了避免这些风险，在禁止将抗生素抗性基因用于制备治疗性质粒方面以及开发代替性的筛选方法方面已经进行了不懈的努力。

在尝试实现无抗生素筛选方面，已经使用了能够补偿宿主营养缺陷型的质粒。但是，该方法以及所有相关方法的主要的缺点在于需要在质粒插入另外的基因(例如等，2004)。

另外一种方法是称为“阻抑蛋白滴定”的思想(Wiliams等，1998)。根据该思想，包含kan基因(卡那霉素抗性基因)修饰的大肠杆菌宿主株在lac操纵子/启动子控制下。在缺失诱导剂(IPTG或者异乳糖)的情形下，该株不能在包含卡那霉素的培养基中生长。用包含lac操纵子的高拷贝数目的质粒转化导致kan表达，通过从操纵子滴定lacI。在加入卡那霉素之后，只有包含高质粒拷贝数的细胞能够生存。该思想的主要缺点再次地在于使用抗生素不可缺少。

本发明的目的在于提供一种不用抗生素的新颖的质粒筛选体系。

为了解决本发明的问题，已经开发了通过使用带有ColE1复制起点的质粒的复制机制(在下文中，带有ColE1复制起点的质粒称为“ColE1-型质粒”)。

大量天然存在的质粒以及许多最常用的克隆工具是ColE1-型质粒。这些质粒复制其DNA，利用涉及合成两种RNA分子的常规的机制，这些分子一方面相互作用并且另一方面与模板质粒DNA相互作用(Helinski,1996；Kues和Stahl,1989)。

代表性的ColE1-型质粒是天然存在的ColE1质粒pMB1、p15A、pJHCMW1，以及常用的以及商业提供的克隆工具如pBR322以及相关的载体，pUC质粒、pET质粒以及pBluescript载体(例如Bhagwat和Person,1981；Balbas等，1988；Bolivar,1979；Vieira和Messing,1982)。