[发明专利]黄芪愈伤组织和黄芪悬浮细胞的快速繁殖方法

权利要求书

1.一种黄芪愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌外植体的获得、愈伤组织的诱导、悬浮细胞培养、稀土调控黄芪悬浮细胞中黄酮皂苷的含量，其主要步骤如下：

（1）按照植物组织培养常规消毒方法对野外采取的外植体材料进行消毒处理，获得无菌的外植体；

（2）将步骤（1）获得的无菌黄芪叶片，芽接种到愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导，诱导出来的愈伤组织接种入增值培养基中进行愈伤组织增值，增值培养4-5代，获得嫩绿松散的愈伤组织；

（3）将步骤（2）获得的嫩绿松散的愈伤组织接种到附加激素0.5-1.5 mg/L NAA和1-3 mg/L IBA的MS培养基中进行震荡悬浮培养，培养2-3代获得黄芪悬浮细胞；

（4）将步骤（3）获得的黄芪悬浮细胞接种入MS+  1mg/LNAA+2mg/LIBA+稀土1-3mg/L，收集黄芪悬浮细胞称重，然后分两份，一份-70℃冰箱保存鲜样，一份60℃烘干保存干样。

2.按照权利要求1的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述无菌的黄芪外植体叶片和芽按照下述方法得到：取黄芪叶片和芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗50分钟，经次氯酸钠消毒处理12分钟，无菌水冲洗5遍，用吸水纸吸去无菌外植体表面的水分。

3.按照权利要求1的制备方法中，其特征在于：所述的培养条件为温度25℃，湿度50%～70%，光强度2000lx；光期14 h暗期10h。

4.按照权利要求1的制备方法中，其特征在于：步骤（2）所述的黄芪愈伤组织按照按照下述方法得到：将获得的无菌黄芪叶片和芽切成1cm²小块，接种入MS培养基中进行愈伤组织诱导，每瓶接种4块，附加激素1mg/LNAA，3mg/L2，4-D，蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH=8，初代培养30天，连续继代4-5次，继代周期20天，获得嫩绿松散的愈伤组织。

5.按照权利要求1的制备方法中，其特征在于：步骤（3）所述的黄芪悬浮细胞按照按照下述方法得到：取诱导出来的嫩绿松散的愈伤组织，接种到盛有40 mLMS液体培养基100 mL三角瓶中，接种后置于旋转式摇床振荡培养，摇床转速为120 r/min，温度25℃，初次液体培养愈伤组织生长旺盛，摇匀培养液后稍置片刻，用颗粒适中的悬浮细胞团进行继代培养，换用200 mL三角瓶装60 mL液进行培养，再继而用500 mL三角瓶装120 mL液培养，以进行悬浮培养系的诱导。

6.按照权利要求1的制备方法中，其特征在于：步骤（4）所述稀土对黄芪悬浮细胞的调控按照下述方法实施：将1-3mg/l稀土溶液加入诱导出的悬浮培养系中进行调控，25天后取样测定黄芪皂苷的含量，精密称取干样品1g， 60℃烘干，研磨后过80目筛，加入65%的乙醇和水1：1，溶液30ml放入超声波中，60℃超声提取45min，过滤弃残渣，使用65%的乙醇定容至100ml，摇匀后，取1. 00 mL提取液加入试管，再分别加入1. 00 mL 8%香草醛试剂，置于冰浴中缓缓加入10. 0mL体积分数为72%的硫酸，摇匀，放入70℃水浴中，保温25 min，取出置于室温冷却，摇匀，立即于波长542 nm处测定吸光度，测定3次求平均值。

7.按照权利要求1的制备方法中，其特征在于：步骤（4）中所述的稀土是硝酸铈稀土。

8.按照权利要求1的制备方法中，其特征在于：步骤（4）中所述的黄芪皂苷提取方法为超声提取法。