[发明专利]一种酶活及热稳定性提高的过氧化氢酶突变体

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶活及热稳定性提高的过氧化氢酶突变体，属于生物工程技术领域。

背景技术

过氧化氢酶(catalase)简称CAT，其系统名称是：H₂O₂氧化还原酶，以H₂O₂为专一底物，通过催化一对电子的转移而最终将其降解为水和氧气。过氧化氢酶在纺织、食品、医药、临床等行业都有着广泛的用途。过氧化氢酶在食品加工工业中可使食品保鲜，并作为消除啤酒、饮料中活性氧和自由基的抗氧化剂。与葡萄糖氧化酶并用作氧的去除剂，牛乳杀菌及干酪原料乳的杀菌；在医药行业常用于器械消毒；在临床分析中，过氧化氢酶对研究自由基代谢失衡，抗衰老和肿瘤发病机理具有一定价值，对某些疾病的诊断，鉴别诊断亦具有重要意义上等行业有着广泛的用途。迄今CAT已经成为农业，以及与之相关的食品与乳制品业、纸浆和造纸业、以及农业环保产业中有应用价值的酶之一。近年来随着过氧化氢酶在纺织、造纸、制浆等行业的普遍应用，市场对过氧化氢酶的需求大幅增长。

近年来嗜热子囊菌，粘质沙雷氏菌，苹果炭疽菌、芽孢杆菌等微生物菌种均有用于过氧化氢酶的生产研究。但利用野生菌株生产过氧化氢酶，资源消耗大、原料利用率低、产量较低，难以满足日益增长的市场需求；通过传统方法育种，工作量大、盲目性大、回复突变率高，难以筛选得到理想的突变菌株。有通过重组大肠杆菌生产过氧化氢酶，但大肠杆菌本身产生的热源、内毒素不易除去，产品纯化问题较多；蛋白的高水平表达常形成包涵体，提取和纯化步骤繁琐，而且蛋白复性困难，易出现肽链的不正确折叠等问题。生物安全性要求我们的宿主菌最好具有非致病性。而绝大多数芽孢杆菌恰恰能满足这一要求，而且还具备了一些其他菌株所没有的优良特性。事实表明，芽孢杆菌可以作为一些原核生物、真核生物和哺乳动物等的外源蛋白的表达宿主。芽孢杆菌表达系统具有的非致病性；细胞壁的组成简单；能够大量分泌某些胞外蛋白，蛋白跨越细胞膜后，被加工和直接释放到培养基中而不发生聚集，回收和纯化蛋白较为简单等优点，使之成为CAT的良好表达宿主。

过氧化氢酶活性可被苯酚类、尿素、氰化合物、叠氮化物、碱等物质所抑制，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis WSHDZ-01）具有耐热耐碱的特性，且已用于工业化生产，利用该菌株作为宿主过量表达CAT，发酵条件易于控制，可大幅度提高CAT的产量。

江南大学的郭娅琼从枯草芽孢杆菌（B.subtilis WSHDZ-01）基因组中获得编码过氧化氢酶（CAT）的基因katA带有自身信号肽和启动子序列，与质粒pSTOP1622上具有的木糖启动子构成了双启动子表达系统，在一定程度上增加了过氧化氢酶mRNA的转录量，促使CAT的表达，很大程度地提高了CAT的产量。但该过氧化氢酶也存在着一定的缺陷，尤其是其对温度比较敏感，使得其在工业应用中有一定的局限性。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种酶活及热稳定性提高的过氧化氢酶突变体(CAT)。是对氨基酸序列如NCBI登录号BAB21251.1所示的过氧化氢酶第114位的赖氨酸K进行定点突变，将含突变后基因的重组质粒转化进入枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WSHDZ-01进行表达，得到酶活及热稳定性均增强的过氧化氢酶突变体。

编码所述亲本过氧化氢酶的核苷酸序列如NCBI登录号为AB046412的序列所示。

所述突变是将第114位的赖氨酸K分别变为酪氨酸Y、缬氨酸V、蛋氨酸M或异亮氨酸I。

获得所述突变体的方法，是以pSTOP1622-katA质粒（一种高产过氧化氢酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用，申请号：201110328753.1）为模版，设计引物，通过PCR进行定点突变得到含有突变后基因的重组质粒pSTOP1622-katKX，将pSTOP1622-katKX转化枯草芽孢杆菌（B.subtilis WSHDZ-01）发酵生产CAT。

所述枯草芽孢杆菌（B.subtilis WSHDZ-01）购买于武汉中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NO：M206062。

获得所述突变体的方法，具体地是：

（1）突变表达载体的构建

通过分析过氧化氢酶的3D结构，确定114位的赖氨酸K为目的突变为点，设计突变实验，将该位点的赖氨酸分别突变为酪氨酸Y、缬氨酸V、蛋氨酸M或异亮氨酸I。