[发明专利]一种氨基甲酸乙酯水解酶基因及其编码的蛋白质和应用

说明书

技术领域

本发明公开了一种氨基甲酸乙酯水解酶基因及其编码的蛋白质，特别是一种来源于梭形赖氨酸芽孢杆菌的氨基甲酸乙酯水解酶基因及其编码的蛋白质。

背景技术

氨基甲酸乙酯（英文名：urethane或ethyl carbamate，简称EC）又名乌拉坦、尿烷，是一种医药、农药、香料的中间体，或用于生产安眠药、镇静剂、注射剂的助溶剂和印染工业着色剂，也可用于生物化学研究。此外，尿烷本身可作成药使用，具有抗癌性能，用于治疗多发性骨髓瘤和慢性白血病等。

20世纪40年代，Nettleship实验证明了氨基甲酸乙酯具有致癌作用。主要可以引起肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等。氨基甲酸乙酯作为副产物广泛存在于发酵食品（如面包、酸牛奶、乳酪、酱油等）和酒精饮料（如葡萄酒、黄酒、苹果酒和日本清酒等）中。人体摄取氨基甲酸乙酯主要是通过饮用酒精饮料和食物。氨基甲酸乙酯已成为影响人类健康的一个不可忽视的因素。

目前各国政府对发酵食品中EC的含量已出台相应的限量标准。我国生产的白酒、葡萄酒、酱油等中也广泛存在着氨基甲酸乙酯，这不仅制约我国相关产品的出口，更影响普通消费者的健康。因此采取有效的方法控制或消除发酵食品或饮料中的氨基甲酸乙酯迫在眉睫。

上世纪90年代，日本科学家筛选到一些能够降解氨基甲酸乙酯的菌株，例如Bacillus licheniformis、Citrobacter sp.、Micrococcus species等，能够将氨基甲酸乙酯降解为乙醇、氨和二氧化碳，将致癌物转变成无毒的有机分子，有效的解决了食品的安全性问题。但野生菌产酶量小、蛋白纯化步骤繁琐、有些为非安全性菌株等原因，一直未在食品工业中广泛应用，这使得挖掘具有氨基甲酸乙酯水解酶活性的基因、构建高效外源表达体系具有重要的意义。通过基因工程的手段，直接克隆和表达所需的氨基甲酸乙酯水解酶，改变野生菌产酶量不足等问题，为氨基甲酸乙酯水解酶的工业化应用提供了新思路并奠定了基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题为提供一种氨基甲酸乙酯水解酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或为编码SEQ ID NO:2所示蛋白质的核苷酸序列。

本发明通过将纯化自梭形赖氨酸芽孢杆菌的氨基甲酸乙酯水解酶做N端测序，将N端12氨基酸残基与NCBI数据库比对，通过设计特异性引物将编码氨基甲酸乙酯水解酶的基因扩增并构建重组载体转化宿主细胞，对此基因在大肠杆菌中进行表达。因此，本发明的目的是提供一种氨基甲酸乙酯水解酶基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，以及其在制备重组氨基甲酸乙酯水解酶中的应用。

本发明采用的具体技术方案是通过将已经测序得到的氨基甲酸乙酯水解酶N端12个氨基酸残基与NCBI数据库比对，根据比对结果设计特异性引物扩增目的基因并连接克隆载体，测序得到其核酸序列，如序列表中SEQ ID NO.1所示，其中，其编码序列（CDS）从DNA第1个碱基起至第1419个终止，ATG为转录起始密码子，TAA为转录终止密码子；通过序列翻译得到如序列表中SEQ ID NO.2所示。当然，如本领域技术人员所知，本发明氨基甲酸乙酯水解酶基因还可以是编码由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其它核苷酸序列；而本发明的氨基甲酸乙酯水解酶不仅仅限于是具有序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸组成的序列，还可以是将序列2中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有相同酶活性的由序列2衍生的蛋白质，比如在C端和/或N端添加或缺失一个或数个氨基酸残基，添加融合标签等，虽然在形式上进行修饰但不改变蛋白的酶活。

所述氨基甲酸乙酯水解酶基因可得自梭形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis），如Lysinibacillus fusiformis SCO2等菌株。

含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的基因表达载体也为本发明的保护范围，其是用常规的生物技术手段将克隆得到的目的基因序列连接入各种基因表达载体而构建成功，该使用的载体可以是市售的质粒、粘粒、噬菌体等，其中优选表达载体pET20b(+)。