[发明专利]一种小菜蛾肽聚糖识别蛋白及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子微生物学领域，具体地，涉及一种小菜蛾肽聚糖识别蛋白及其制备方法与应用。 

背景技术

小菜蛾是世界性迁飞害虫，主要危害甘蓝、紫甘蓝、青花菜、薹菜、芥菜、花椰菜、白菜、油菜、萝卜等十字花科植物。它具备典型的昆虫进化优势，如体小，繁殖能力强，生态适应力强等，最主要的是产生了极强的抗药性，目前对多种农药产生了抗药性，如吡虫灵，毒死蜱、BT、阿维菌素等。上世纪90年代年许多地方面对小菜蛾猖獗，无药可治。由于发生面积大、危害时间长、防治困难，小菜蛾逐渐取代菜青虫而成为蔬菜第1号害虫，每年对农业生产造成巨大损失。随着生物技术的发展，将会寻找到更多的防治小菜蛾的农药新靶标。 

    肽聚糖(peptidoglycan)是由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸交替连接的杂多糖与不同组成的肽交叉连接形成的大分子。肽聚糖是许多细菌细胞壁的主要成分，尤其在革兰氏阳性细菌中，其所含的肽聚糖占细胞壁干重的50~80%。 

肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins，PGRPs)是一种天然免疫分子，广泛存在于在脊椎动物中，能够特异性识别肽聚糖。肽聚糖识别蛋白通过识别入侵病原细菌的肽聚糖，进而激活Toll和Imd等免疫信号通路并介导吞噬作用，因此在抵抗病原入侵的过程当中发挥着重要的作用。在结构上，肽聚糖识别蛋白在其序列的C端含有一个酰化酶(amidase)结构，该结构约有165个氨基酸，从昆虫到哺乳动物都显示出高度的保守性，但在PGRP结构域之外，氨基酸序列差异较大。该结构在某些肽聚糖识别蛋白中具有酰胺酶活性，这种活性能够降解细菌细胞壁中肽聚糖的酰胺键，导致细菌死亡，因此这类肽聚糖识别蛋白具有杀菌能力。 

关于昆虫中肽聚糖识别受体的研究最早始于1996 年，Yoshida H等从家蚕血淋巴中发现并纯化得到了一个具有信号肽、等电点为6.5和分子量为19 kD 的蛋白，并将其命名为PGRP，也是生物界最早从昆虫中得到的小型肽聚糖识别蛋白，在无钙离子存在的条件下，该蛋白能结合肽聚糖和含肽聚糖的细菌。根据结构，肽聚糖识别蛋白可以分为两个亚型，包括长型和短型。昆虫的PGRP-L主要表达于血细胞，PGRP-S存在于血淋巴、表皮和内脏，在血细胞中也有少量表达，其中有些PGRPs是组成型表达，如PGRP-SA/SD/SB，也有一些PGRPs是诱导型表达，如PGRP-LC。而对于小菜蛾的肽聚糖识别蛋白及其识别机制至今无相关报道。  

发明内容

本发明的目的是提供一种小菜蛾肽聚糖识别蛋白。 

本发明的目的是提供一种小菜蛾肽聚糖识别蛋白的制备方法。 

本发明的另一个目的是提供一种小菜蛾识别蛋白的应用。 

本发明通过以下技术方案予以实现上述目的： 

一种小菜蛾肽聚糖识别蛋白PGRP-S1基因，其核苷酸序列如如SEQ ID NO:1～2所示。

一种小菜蛾肽聚糖识别蛋白PGRP-S1，其氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。 

一对扩增小菜蛾肽聚糖识别蛋白PGRP-S1基因的引物，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：11～12所示。 

    一种重组表达载体，由出发载体的多克隆位点插入SEQ ID NO:1～2所述小菜蛾肽聚糖识别蛋白PGRP-S1基因的核苷酸序列。 

一种重组菌株，所述菌株含有小菜蛾肽聚糖识别蛋白PGRP-S1基因。重组菌株是由如上所述的重组表达载体转化受体菌株构建所得。 

如上所述小菜蛾肽聚糖识别蛋白PGRP-S1基因的克隆方法包括如下步骤：（1）根据转录组测序所得的PGRP Unigene序列，分别设计3’RCAE引物和5’RCAE引物（2）用革兰氏阳性菌处理小菜蛾幼虫，抽提RNA，反转录成RACE cDNA，经过多次Download PCR扩增得到全长。 

测定如上所述小菜蛾肽聚糖识别蛋白PGRP-S1基因在其体内的时空表达情况，目的是为了鉴定PGRP-S1基因在小菜蛾体内的表达模式。 

如上所述的小菜蛾聚糖识别蛋白PGRP-S1基因对真菌玫烟色拟青霉具有免疫识别作用。 

本发明的有益效果： 

本发明从重要农业害虫小菜蛾中首次克隆得到肽聚糖识别蛋白PGRP-S1基因。并对其时空表达模式和对真菌真菌玫烟色拟青霉进行了转录水平的检测，为在生产上利用玫烟色拟青霉来防治小菜蛾的危害奠定基础，具有非常重大的意义。

附图说明