[发明专利]一种多环芳烃完全抗原,多环芳烃单克隆抗体和分泌该抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及多环芳烃的完全抗原包括免疫原和包被原，由免疫原免疫实验动物制备的杂交瘤细胞株和该杂交瘤细胞株产生的抗多环芳烃单克隆抗体。

背景技术

多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)是一大类广泛存在于环境中的有机污染物，由两个或多个芳香环构成。主要由煤，石油等有机物的不完全燃烧而产生。许多种类的PAHs及其代谢物可通过呼吸道和皮肤接触进入人体，对人体产生较强的致癌作用。

多环芳烃的监测和分析技术主要包括以下几个方面：

1、由于PAHs对环境造成的污染及对人类健康的威胁，一些国家都通过书面法律和法令规定了对多环芳烃的检测限值要求，包括欧盟76/769/EEC，德国GS认证，LFGB。美国国家环保局(USEPA)将16种PAHs(芘、荧蒽、苯并(b、k)荧蒽、芴、苯并芘、萘、菲、二苯并蒽、苯并蒽、苊、苯并苝、蒽、苊烯、屈、茚并芘)列为优先控制污染物，对其进行严格的监管和控制。我国国家标准(GB3092-1996、GB16297-1996、GB5749-85、GB4284-84、GB7104-94)中规定了空气、食品、饮用水等环境介质中多环芳烃的浓度限量。

2、不论是土样，水样，还是大气样，环境样品中PAHs的分析主要包括以下几个步骤：样品采集，PAHs提取，净化和浓缩，仪器分析。最常用的提取方法包括液液萃取，固液萃取，超临界萃取等，仪器分析方法主要是气相色谱法或高效液相色谱法。整个过程步骤繁琐，耗时较长，仪器设备昂贵，不适合对大量样品在短时间的分析和监测，并且在此过程中需要用到甲醇，二氯甲烷，丙酮等有机溶剂。除以上两种主要的仪器分析方法外，用于测定PAHs的方法还有荧光法和酶联免疫吸附分析法。与其它方法相比，酶联免疫吸附分析法具有特异性好，灵敏度高，操作简便快捷，且可同时处理大批量样品等忧点。

发明内容

本发明针对目前多环芳烃检测的不足之处，提供一种特异性和亲和力高的单克隆抗体与产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞。

本发明的思路在于采用多环芳烃完全抗原免疫动物，达到理想效价后进行细胞融合，从而筛选特异性较高的单克隆细胞株，该细胞株可以持续分泌单克隆抗体，便于进行多环芳烃的检出，从而为检测多环芳烃的试剂盒研发奠定了基础。

本发明的目的之一是提供一种特异性分泌多环芳烃单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株于2013年6月18日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.7718，分类名为多环芳烃单克隆抗体杂交瘤细胞株。

本发明的目的之二是提供一种用于免疫实验动物的多环芳烃完全抗原的制备方法，该方法包括如下的步骤：

1、采用活性酯法将芘丁酸(PBA)分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联，按照1：1：1的比例称取芘丁酸、NHS、DCC溶解于N，N-二甲基甲酰胺(N，N-Dimethylformamide)DMF中，室温放置过夜，12000rpm，离心15min，取上清液。

2、4℃搅拌，将上清液缓慢加入8ml BSA溶液(碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液配制成浓度为15mg/ml的BSA溶液)中继续搅拌5h，

3、将溶液装入透析袋中，用蒸馏水透析2d，后用pH7.40.01mor/L PBS缓冲液继续透析，每天更换透析液，直到用紫外分光光度计检测不到PBA的特征吸收峰为止。

4、离心分离出上清液即作为免疫原PBA-BSA，用同样的方法合成PBA-OVA结合物作为ELISA的包被原。

本发明的目的之三是提供一种用于制备抗多环芳烃单克隆抗体杂交瘤细胞株的方法，该方法包括如下的步骤：

1、动物免疫

免疫用小鼠为18g左右的BALB/C，7-8周；免疫之前眼眶取阴性血清。取60μg免疫原“PBA-BSA”，用生理盐水稀释到200μl，再加入等体积弗氏完全佐剂进行皮下注射免疫。此后，每隔两周，进行一次加强免疫，免疫量为30μg蛋白/只小鼠。共进行四次加强免疫后，眼眶取血，测定抗血清效价。选择效价较高的小鼠腹腔冲击免疫，免疫量为50μg蛋白/只小鼠。效价达到1：10000即可做细胞融合。

2、细胞融合

取免疫小鼠的脾脏细胞与状态良好的骨髓瘤细胞SP2/0，采用PEG法进行融合。融合后的细胞用含15％血清的IMDM培养基培养。

3、阳性细胞株筛选