[发明专利]基于细菌荧光素酶BRET技术检测蛋白质相互作用的方法

权利要求书

1.一种基于细菌荧光素酶BRET技术检测蛋白质相互作用的方法，其特征在于，该基于细菌荧光素酶BRET检测蛋白质相互作用的方法包括以下步骤：包括以下步骤：

步骤一，构建克隆pBluescript-pLac::luxAB-MCS；

步骤二，受体蛋白选择绿色荧光蛋白GFP、增强型黄色荧光蛋白eYFP、橙色荧光蛋白mOrange；

步骤三，在MCS处选择酶切位点分别将三种荧光蛋白克隆到MCS处；

步骤四，去掉luxB的终止密码子TAA，形成细菌荧光素酶和荧光蛋白的融合体；

步骤五，分别得到pBluescript-pLac::luxAB-GFP、pBluescript-pLac::luxAB-eYFP、pBluescript-pLac::luxAB-mOramge三个重组载体，产生BRET信号的模式体；

步骤六，通过酶标仪检测三个BRET信号模式体荧光素酶的荧光强度；

步骤七，选择三个模式体荧光强度值都较强作为BRET信号产生的荧光供体；

步骤八，通过生物荧光显微镜Leica检测荧光蛋白，选择合适的荧光受体。

2.如权利要求1所述的基于细菌荧光素酶BRET技术检测蛋白质相互作用的方法，其特征在于，在步骤一中，构建克隆pBluescript-pLac::luxAB-MCS的具体步骤为：

首先以pDM4-luxBox含有luxCDABE基因序列，为模板扩增目的基因，PCR的反应体系为50μL：去离子水33.5μL，10×PCRbuffer5μL，dNTPs5μL，MgSO42μL，正反向引物各1.5μL，模板DNA0.5μL，TaqDNA聚合酶1μL，PCR产物用含0.5μg/mL溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶进行电泳分离，在紫外灯下切下目的条带，用DNA纯化回收试剂盒进行切胶回收。

3.如权利要求2所述的基于细菌荧光素酶BRET技术检测蛋白质相互作用的方法，其特征在于，PCR反应程序为：94℃，反应3min；(94℃,30s；50℃,30s,72℃2.5min)30℃xcycles；72℃10min。

4.如权利要求2所述的基于细菌荧光素酶的BRET技术检测蛋白质相互作用的方法，其特征在于，电泳分离上述PCR产物的条件为：1×TAE缓冲液，电压5V/cm，电泳40min，切胶回收PCR目的条带。

5.如权利要求2所述的基于细菌荧光素酶BRET技术检测蛋白质相互作用的方法，其特征在于，PCR扩增产物50μL双酶切反应体系包括：PCR产物20μL，10Xbuffer5μL，限制性内切酶各1μL，ddH₂O补足体积至50μL；同理也是载体50μL酶切体系：8μL载体质粒，10Xbuffer5μL，限制性内切酶各1μL，最后用去离子水补足体积至50μL，酶切后回收。

6.如权利要求2所述的基于细菌荧光素酶BRET技术检测蛋白质相互作用的方法，其特征在于，连接反应：连接体系包括目的片段6.5μL，酶切后的载体2.5μL，T4buffer1μL，T4DNA连接酶0.3μL，充分混匀后16°过夜连接。

7.如权利要求1所述的基于细菌荧光素酶BRET技术检测蛋白质相互作用的方法，其特征在于，在步骤七中，BRET信号产生的供体选择明亮发光杆菌的细菌荧光素酶基因luxAB基因来自pDM4-luxBox表达的产物细菌荧光素酶。

8.如权利要求1所述的基于细菌荧光素酶BRET技术检测蛋白质相互作用的方法，其特征在于，该基于细菌荧光素酶BRET检测蛋白质相互作用的方法将荧光素酶基因luxAB和eYFP分别克隆到pKT100和pBluescript载体上，并使用Lac启动子来起始基因的转录，得到重组克隆pBluescript-pLac::eYFP和pKT100-pLac::luxAB，然后将luxAB基因和eYFP基因分别与目的蛋白和诱饵蛋白相互融合。