[发明专利]一种酸性磷酸酶突变体、编码基因、载体及应用

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种酸性磷酸酶突变体及其编码基因，以及含有该基因的载体和应用。

（二）背景技术

呈味核苷酸I+G作为新一代食品增鲜剂，由5’-肌苷酸（5’-IMP）和5’-鸟苷酸（5’-GMP）按1:1混合而成。I+G具有比谷氨酸钠（味精）更鲜美的呈味效应，也可与味精混合使用，具有相乘的协同效应，并且能够显著降低产品成本，广泛应用与食品加工领域。

I+G的呈味作用取决于其化学结构，研究发现只有核苷5’-位碳原子上的羟基与磷酸基团发生酯化才表现出鲜味活性，而2’-和3’-位碳原子的羟基磷酸酯化无活性。因此，通过磷酸化反应将肌苷或鸟苷转化为呈味核苷酸，关键是如何使核苷的5’-位磷酸酯化反应。相比化学磷酸化方法而言，利用酸性磷酸酶生物催化无机焦磷酸（PPi）的磷酸根特异地转移到核苷分子的特定位置上，该反应不需要ATP，具有反应条件温和、位置特异性强、转化率高、环境友好等特点，具有独特的优势和潜力。酸性磷酸酶催化肌苷和鸟苷磷酸化生成5’-IMP和5’-GMP的过程如下式所示：

20世纪70年代末，加拿大著名科学家Smith首次发明了寡聚核苷酸定点突变技术，研究表明，多点突变的效果往往比单点突变更为理想。点饱和突变技术在提高催化活性，减少副反应，提高热稳定性，改变底物结合特异性等方面有显著的作用。此外点饱和突变技术在医药，农牧业和环境保护，蛋白质基因表达与调控等研究领域的应用也越来越广阔。点饱和突变技术的原理是在靶位点处设计兼并引物并对目的基因进行扩增以获得靶位点处氨基酸分别被其它19种天然氨基酸所替代的突变子。一般将兼并引物设计成NNN或NNX（N代表4种核苷酸等比例混合物；X代表2种核苷酸等比例混合物（如G/C或G/T）。

Asano等最早开展了酶法磷酸化生产5’-IMP和5’-GMP的研究，首次研究发现了Morganella morganii的磷酸酶具有选择性磷酸化酶活性，对肌苷和鸟苷的催化效率大致相同，为简单的一步转移磷酸基团反应。然后他们从M.morganii中分离纯化得到选择性磷酸化酶，并成功克隆到控制其磷酸转移活性的基因，在此基础上利用易错PCR的技术通过随机突变建立突变文库，成功得到具有两个突变点（G74D/I153T）的磷酸转移活性的基因，将其导入Escherichia coli，得到一株含有G74D/I153T的突变体的高产酸性磷酸酶突变株。由于该酶在转移磷酸基团的同时也在催化磷酸水解，因此要尽可能的抑制其水解活性，针对这一问题，他们找到与M.morganii有着高度同源性的Escherichia blattae，并以E.blattae为出发菌株，采用定点突变，对酸性磷酸酶基因引入突变（S72F/G74D/I153T），成功提高了该酶的磷酸转移活性，同时也降低了其水解酶的活性。Mihara等利用点饱和突变技术对E.blattae酸性磷酸酶EB-AP/PTase的一些活性位点进行突变，获得了一个包含11个氨基酸突变的良性突变体（L63Q，A65Q，E66A，N69D，S71A，S72A，G74D，D116E，T135K，E136D，I153T），该突变酶活性明显提高。

然而，目前酸性磷酸酶EB-AP/PTase存在的主要问题是酶活力相对较低，导致酶法生产I+G成本较高。因此提高酸性磷酸酶酶活力，对推动呈味核苷酸的工业化生产具有重要的意义。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种酶活提高的酸性磷酸酶突变体，为绿色生产呈味核苷酸I+G提供条件。

本发明采用的技术方案是：

一种酸性磷酸酶突变体，由SEQ ID No.1所示氨基酸序列经点突变得到，所述点突变为：第108位突变为丝氨酸，和/或第143位突变为亮氨酸。所述突变体是以SEQ ID No:1为出发序列，经过多轮点饱和突变，筛选获得的酶活力提高的酸性磷酸酶突变体。

具体的，所述酸性磷酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.2（AP/PT-D108S）或SEQ ID No.3所示（AP/PT-D108S/N143L）。

本发明还涉及编码所述酸性磷酸酶突变体的基因。

具体的，所述基因序列如SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示。

本发明还涉及含有所述基因的重组载体，以及所述的基因在制备重组酸性磷酸酶突变体中的应用。

本发明还涉及所述的酸性磷酸酶突变体在生产呈味核苷酸中的应用。