[发明专利]一种ATP释放剂及包含该释放剂的细菌快速检测试剂

说明书

技术领域

本发明涉及ATP释放剂，更具体地说涉及包含该ATP释放剂及荧光素酶的细菌快速检测试剂。

背景技术

荧光素酶（luciferase）是一种能将化学能转变为光能的高效生物催化剂，萤火虫荧光素酶(简称虫荧光素酶，firefly luciferase，FL)以荧光素（Luciferin），三磷酸腺苷（ATP）和O₂为底物，在镁离子(Mg²⁺)存在时，将化学能转化为光能，并发出光量子，反应式如下：

Luciferin+O²+ATP+Mg²⁺+荧光素酶??Oxidized luciferin+CO2+AMP

+Pyrophosphate+hu

ATP既是荧光素酶催化发光的必须底物，又是所有生物生命活动的能量来源。ATP生物荧光法是目前认为最为快速的微生物检测方法。在其它反应底物均过量存在的情况下，荧光素酶催化发射荧光的数值与ATP的量呈线性关系。利用这一特性，早在1947年McElory等就应用FL来测定ATP，此后，荧光素酶在生物化学及生物技术的分析应用方面得到了不断发展。特别是在细菌检测方面，由于各生长时期的细菌有较恒定水平的ATP含量，提取细菌的ATP，利用生物发光法测定出ATP的含量后，即可推算出样品中的含菌量，整个过程仅需十几分钟。由于生物发光法无需培养过程、操作简便、灵敏度高，是目前监测微生物最快的方法之一。荧光素酶由于具有敏感性高、特异性好、反应迅速、操作简单和应用范围广等优点，现已成为医学、生物学、环境科学等研究领域中一种新的手段。因此，对荧光素酶的需求量也日益增加。

作为FL生产原料的萤火虫，其人工扑捉或养殖地域和季节限制，且生产周期长、养殖成本高、提取的酶成分复杂。随着分子生物学技术的发展，人们转向用基因工程方法制备荧光素酶。1985年，De Wet等首次克隆了北美萤火虫（P.Pyralis）的FL基因，并在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达，从中得到具有生物活性的FL。随后，各种发光甲虫的FL基因相继克隆成功，并能在原核和真核表达系统中表达。但是，目前能够提供FL的厂家主要有Promega、Sigma和Roche三家国外公司，随着FL在国内需求量的增加，FL生产的国产化将是大势所趋。

传统荧光素酶的活性中心中含有大量的还原性的氨基酸，他们很容易被氧化从而减低酶的稳定性，故稳定性不强。如要长期保存，需置于-20 ℃的环境下保存，短期保存需置于4 ℃的冰箱内保存，以保存酶的稳定性。商品化ATP检测反应试剂要求在28 ℃的条件下反应，并且一旦配制后必须尽快使用，这一要求难以使ATP检测反应试剂在野外高温的环境中使用。本发明成功研制了耐热荧光素酶，在40 ℃环境中放置25 min 后活性保留90％以上，在37 ℃的条件下放置1 h 后其灵敏度基本不变，稳定性得到了提高。可用于现场快速检测细菌，从而拓广了ATP检测反应技术的应用领域。

ATP释放剂的作用是破坏细胞结构使其释放出ATP，而细胞中有一些分解ATP的酶类，可能在短时间内分解ATP，同时不同的释放剂可能对酶的活性有影响，因此还选择一个合适的释放剂，即能破坏细胞释放ATP，也能破坏细胞内的分解ATP酶类的活性，同时又不会在短时间内对荧光素的活性有太大影响。目前使用的ATP释放剂有煮沸法、稀酸法、稀碱法、表面活性剂法等。稀酸对酶类的破坏性一样，无特异性；一定浓度二甲基亚砜能改变细胞膜的通透性，使ATP释放出来，但对细胞内的ATP酶类无特异性破坏；常用的表面活性剂SDS破坏荧光素酶的活性，使酶变性失活；TritonX-100、苯扎溴铵等释放ATP效果不显著。本发明研制出的5-（4-正壬烷基-苯基）-1-已烷磺酸钠属于磺酸类离子表面活性剂，可解决以上问题，提高ATP的释放效果。

 

发明内容

本发明首先所要解决的技术问题是提供一种ATP释放剂，该释放剂为5-（4-正壬烷基-苯基）-1-已烷磺酸钠，其化学式为                                                。

本发明所述的ATP释放剂可按以下步骤制备：

    

首先，第一步反应中，取正壬基苯和4-已烯基-1-磺酸，置于不锈钢反应釜中，密闭状态磁力搅拌反应，逐步加热到 120℃，反应 5h，静置冷却；取出反应产物于蒸馏瓶中，加热减压蒸馏出未反应的正壬基苯，得5-（4-正壬烷基-苯基）-1-已烷磺酸。