[发明专利]一种利用混合模式层析介质连续分离纯化抗体的方法

权利要求书

1.一种混合模式层析柱串联连续吸附装置，其特征在于，包括串联设置的n个填充有MEP HyperCel层析介质或者配基密度为10-120mmol/g的以4（咪唑-1-基）苯胺为配基的混合模式层析介质的层析柱，用于从包含抗体和至少一种杂蛋白的生物原料中连续吸附抗体来分离纯化抗体；

其中，所述以4（咪唑-1-基）苯胺为配基的混合模式层析介质是以平均粒径为20-270μm的琼脂糖凝胶、纤维素或羟基化甲基丙烯酸亲水聚合物微球为基质，在所述基质表面偶联烯丙基，然后通过烯丙基与N-溴代琥珀酰亚胺溴代反应得到的活化末端基团偶联4（咪唑-1-基）苯胺为配基的层析介质，其结构式为M-L-AN；M表示基质，L表示由烯丙基活化引入的短链烷基，AN表示4（咪唑-1-基）苯胺。

2.根据权利要求1所述的一种混合模式层析柱串联连续吸附装置，其特征在于，所述以4（咪唑-1-基）苯胺为配基的混合模式层析介质的配基密度为21-70mmol/g。

3.根据权利要求1所述的一种混合模式层析柱串联连续吸附装置，其特征在于，所述配基密度为10-120mmol/g的以4（咪唑-1-基）苯胺为配基的混合模式层析介质的制备方法为：

经去离子水反复冲洗并抽干水分后的基质M与二甲基亚砜、氢氧化钠溶液和烯丙基溴混合，混合液中二甲基亚砜的体积含量为3-60%，氢氧化钠的摩尔体积浓度为0.01-4mol/L，基质M与烯丙基溴的质量体积比为0.1-20:1，混合液在25℃和170rpm的水浴摇床中反应1-64h获得烯丙基活化介质M-L；其次，活化介质M-L反复洗涤后与水、二甲基亚砜和N-溴代琥珀酰亚胺混合，上述混合液中水与二甲基亚砜的体积比为0-10，二甲基亚砜的体积含量为3-70%，活化介质M-L与N-溴代琥珀酰亚胺的质量比为0.5-7:1，混合液在25℃和170rpm的水浴摇床中反应0.5-5h；最后，反应后的活化介质经去离子水洗涤并抽干水分后与4（咪唑-1-基）苯胺、氢氧化钠溶液和二甲基亚砜溶液混合，活化介质M-L与4（咪唑-1-基）苯胺的质量比为0.008-0.64：1，二甲基亚砜与活化介质的体积质量比为0.2-5.0：1，氢氧化钠的摩尔体积浓度为0.01-1.0mol/L，上述混合液在50℃和170rpm的水浴摇床中反应1-72h，即得。

4.根据权利要求1-3任一所述的混合模式层析柱串联吸附装置，其特征在于，n=2-5。

5.一种利用权利要求1-4任一所述的混合模式层析柱串联吸附装置连续分离纯化抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）制备待层析分离的、含有目标抗体产品的生物原料样品；

（2）将所述生物样品用适当的平衡缓冲液进行稀释，稀释的生物样品输入到所述混合模式层析柱串联连续吸附装置；

（3）稀释生物样品输入达到一定体积后，处于串联连续吸附装置最前端的层析柱离开吸附步骤进入到冲洗步骤；同时，一个经再生处理后的新层析柱则接入到串联连续吸附装置最末端；稀释生物样品继续连续输入到新的串联连续吸附装置中；

（4）向进入到冲洗步骤的吸附抗体的层析柱中输入所述平衡缓冲液进行冲洗；

（5）用适用的洗脱缓冲液将抗体从经步骤（4）冲洗后的层析柱中洗脱，收集洗脱峰，获得抗体溶液；

（6）依次输入所述的再生缓冲液和平衡缓冲液以再生步骤（5）中经洗脱后的层析柱。

6.根据权利要求5所述的连续分离纯化抗体的方法，其特征在于，所述步骤（6）中，还包括将再生后的层析柱接入到串联连续吸附装置最末端，继续用于抗体的连续吸附及分离纯化的步骤。

7.根据权利要求5-6任一所述的连续分离纯化抗体的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，还包括将所述冲洗的层析柱流出物收集的步骤，用于步骤（2）中所述的用于层析吸附的稀释生物样品中。

8.根据权利要求5-7任一所述的连续分离纯化抗体的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，还包括将所述稀释的生物样品离心的步骤，用于去除生物样品中的不溶物和沉淀的杂质成分。