[发明专利]密码子优化的猪圆环病毒2型Cap蛋白编码基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及密码子优化的猪圆环病毒2型Cap蛋白编码基因及其应用。

背景技术    

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PWMS）的主要病原，它不但可以导致断奶仔猪发生衰竭、死亡，还与仔猪A2型先天性震颤（AII，CT）、怀孕母猪流产、成年猪皮炎肾炎综合征（PDNS）和呼吸道疾病综合征（PRDS）密切相关。自1991年加拿大首次报道PMWS以来，该病现已波及世界各地，在我国猪群中流行十分严重，给全世界养猪业造成了重大的经济损失。在2010年国际猪兽医大会（IPVS）上，猪圆环病毒2型感染成为关注度最高的疾病，是全球公认的危害养猪业的重要传染病之一。近年来，国内猪圆环病毒2型感染呈上升趋势。

PCV2含有两个主要的开放阅读框：ORFl和ORF2。ORFl编码两种复制酶蛋白，参与病毒复制；ORF2编码的Cap蛋白，是PCV2的核衣壳蛋白，也是该病毒主要的免疫原性蛋白。McNeiUy等研究证实Cap蛋白免疫动物可以产生病毒的中和抗体，已经作为研制基因工程疫苗的重点对象。

现有技术中，国外以杆状病毒表达的Cap蛋白作为抗原的PCV2亚单位疫苗已经商品化，免疫动物后，能有效降低病毒血症的发病率。但是杆状病毒表达系统生产成本高、表达量低。也有研究人员用大肠杆菌表达系统制备Cap蛋白，但是由于Cap蛋白基因含有大量的稀有密码子，不能实现可溶性表达、不能形成病毒样颗粒，即制备的Cap蛋白不能正确折叠，没有好的免疫原性。

发明内容    

本发明的目的是提供一种密码子优化的猪圆环病毒2型Cap蛋白编码基因，易于在大肠杆菌中可溶性表达，表达的重组蛋白可体外组装成病毒样颗粒，具有很好的免疫原性。

本发明的另一目的是提供含有上述基因的重组表达载体和重组菌。

本发明再一目的是提供利用上述重组菌制备猪圆环病毒2型病毒样颗粒的方法，该方法简单，成本低，能够实现猪圆环病毒2型Cap蛋白的可溶性表达、并自我组装成病毒样颗粒，具有很好的免疫原性。

本发明的再一目的是提供以上述制备的猪圆环病毒2型病毒样颗粒为活性物质的疫苗，用于预防猪圆环病毒2型感染，具有免疫原性好，免疫后的猪能够产生较高水平的抗体，个体间抗体水平整齐度好，攻毒后能够起到有效的保护效果。

一种密码子优化的猪圆环病毒2型Cap蛋白编码基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

含有所述基因的重组载体。所述重组载体是将权利要求1所述基因插入表达载体所得。所述表达载体为pTXB1。

含有所述基因的重组菌，是将所述基因的重组载体导入宿主菌中得到的重组菌；所述重组载体是将所述基因插入表达载体pTXB1所得。

所述基因、所述重组载体或所述重组菌在制备猪圆环病毒2型Cap蛋白中的应用。

一种制备猪圆环病毒2型病毒样颗粒的方法，诱导所述重组菌表达猪圆环病毒2型Cap蛋白，将重组菌裂解，取裂解液，纯化后获得猪圆环病毒2型病毒样颗粒。

所述裂解液的纯化方法为：将裂解液离心取上清液，加入硫酸铵至溶液中硫酸铵的饱和度为15-25%，静置、离心取沉淀，用缓冲液溶解，得到所述病毒样颗粒。

以所述猪圆环病毒2型病毒样颗粒为活性成分的基因工程亚单位疫苗。该疫苗中使用的佐剂为206佐剂。

在本发明中，术语“206 佐剂”是指法国赛比克(SEPPIC) 公司生产的Montanide ISA 206 系列的佐剂，包括Montanide  ISA  206、ISA  206VG 等，该佐剂属于油乳佐剂，是一类含十八烷酸和无水甘露醇酯的水包油包水型(w/o/w) 免疫佐剂。

有益效果

密码子优化的猪圆环病毒2型Cap蛋白编码基因插入表达载体，导入宿主菌后，能够实现重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的大量可溶性表达。可溶性表达的猪圆环病毒2型Cap蛋白具有天然Cap蛋白的结构与抗原性，在体外可以自我组装成病毒样颗粒（VLP），具有很好的免疫原性。

本发明猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法简单，生产成本低廉。

采用本发明重组猪圆环病毒2型病毒样颗粒制备的疫苗，用于预防猪圆环病毒2型感染，具有免疫原性好、抗体水平较高、个体间抗体水平整齐度好，攻毒后能够起到有效保护的优点。