[发明专利]一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法和应用

说明书

技术领域

    本发明属于生物工程领域。具体的说，本发明涉及一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法和应用。

背景技术

      粘红酵母（Rhodotorula glutinis (Fres.) Harrison）是一种重要的工业菌株，可以生产微生物油脂和其他活性物质，包括类胡萝卜素、L-苯丙氨酸、过氧化物歧化酶，近年来日益受到营养学家和药理学家的重视。

      目前对于产油粘红酵母基因工程改良的报道不多，特别是以提高亚油酸含量为目的的基因工程改良还未有报道，而亚油酸是人体的必需氨基酸，因此提高粘红酵母油脂中亚油酸的含量有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种粘红酵母野生菌株的构建方法，以提高粘红酵母油脂中亚油酸的含量。

本发明的技术方案还在于采用了一种粘红酵母生产高亚油酸的基因工程菌的构建方法，利用35S强启动子和油桐vfFAD2基因构建重组表达载体导入粘红酵母，使vfFAD2在粘红酵母种获得高校表达，其基因工程菌构建的具体步骤如下：

（1）采用同源序列克隆方法，以油桐基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增得到的产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒回收纯化，进行TA克隆，并测序，获得目的基因vfFAD2；

（2）目的基因vfFAD2与表达载体pBI121重组，获得重组载体pBI121-vfFAD2，酶切、测序验证重组载体；

（3）利用农杆菌介导法，重组载体pBI121-vfFAD2转化粘红酵母，将微孔滤膜转移到含60 μg·mL-1链霉素，200 μg·mL-1头孢霉素和100 μg·mL-1卡那霉素的SMⅠ筛选培养基中，培养3-5 d后，将初筛得到的转化子与野生型粘红酵母同时在含300 μg·mL-1头孢霉素，150 μg·mL-1卡那霉素的SMⅡ平板上划线，培养3-5 d后，能正常生长的初步认定为阳性转化子；

（4）提取基因组DNA、PCR验证获得阳性转化子；

（5）气相色谱法检测，转基因粘红酵母转化子中亚油酸含量和粘红酵母野生型相比，亚油酸相对含量则分别从6.65%提高到13.49%，提高了102.86%。

作为优选，所述步骤（2）中扩增引物为：

FAD2-F：5’-TGTCCTCCGTTCATTCTCAT-3’；

FAD2-R：5’-GCAAGACGGTAGAGACCAAA-3’

PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；72 ℃延伸10 min；PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

进一步地，本发明的技术方案还采用了一种粘红酵母转化子的筛选方法，所述步骤（4）首先用60 μg·mL-1链霉素，200 μg·mL-1头孢霉素和100 μg·mL-1卡那霉素的SMⅠ筛选培养基培养3-5 d后，再将初筛得到的转化子与野生型粘红酵母同时在含300 μg·mL-1头孢霉素，150 μg·mL-1卡那霉素的SMⅡ平板上划线筛选，最后提取基因组DNA，进行PCR验证。

本发明的技术方案还采用了一种粘红酵母的培养方法，其方法具体步骤如下：