[发明专利]一种降低野生型人鼠杂交瘤AL细胞自发突变背景的方法

权利要求书

1.一种降低野生型人鼠杂交瘤A_L细胞自发突变背景的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）野生型细胞收集

收取培养至对数生长期的细胞，酶解消化，悬浮于F12完全培养基中，清洗后制成浓度为±10⁶细胞/100μl的单细胞悬液；

（2）与荧光抗体的结合

加100μl预冷的流式细胞缓冲液重悬细胞后，按配比浓度加入荧光标记的CD59特异性抗体，4℃避光反应30～60分钟后，用预冷的FACS Buffer清洗离心，去除未结合的抗体；

（3）制备上样悬液

重悬细胞于预冷的流式细胞缓冲液后，送入流式细胞分选仪待测；

（4）细胞分选

使用流式细胞分选仪进行分选；

（5）保存

将分选获得的未突变细胞扩增，液氮保存。

2.根据权利要求1所述的一种降低野生型人鼠杂交瘤A_L细胞自发突变背景的方法，其特征在于，所述细胞包括A_L细胞、由该细胞发展的各种缺陷型细胞以及构建的细胞系。

3.根据权利要求1所述的一种降低野生型人鼠杂交瘤A_L细胞自发突变背景的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，酶解消化所用的为胰蛋白酶，为质量含量为0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA溶于PBS缓冲液制得。

4.根据权利要求1所述的一种降低野生型人鼠杂交瘤A_L细胞自发突变背景的方法，其特征在于，所述步骤（4）包括以下步骤：

a、建立前向散射FSC/侧向散射SSC散点图，通过初步设定门P1，排除死细胞和细胞碎片，找到目标细胞群；

b、建立SSC-W/FSC-W散点图，通过二次设定门P2，排除双联体细胞；

c、建立PE-A/FSC-A荧光分析点图,根据对照细胞群位置设定阴阳性界定门，界定门以下为阴性CD59^-细胞群，界定门以上为阳性CD59⁺细胞群。

5.根据权利要求1所述的一种降低野生型人鼠杂交瘤A_L细胞自发突变背景的方法，其特征在于，所述分选获得的细胞用于连续培养，或者作为CD59基因流式检测突变技术中的阳性CD59⁺和阴性CD59^-对照细胞。