[发明专利]单管同时检测四种牛传染病RNA病毒的PCR方法

权利要求书

1.在单个PCR反应管中同时检测四种靶核酸的实时荧光PCR方法，所述靶核酸来自牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹泻病毒、牛呼肠孤病毒，同时用RNA内标进行全程监控，步骤主要包括： 

(1)提取样品中的核酸，获得病毒总核酸提取液； 

(2)在所述单个PCR反应管中混合核酸提取液、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物对和探针、内标引物对及探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中， 

靶核酸引物对包括： 

牛副流感病毒： 

BPIV-L：GGA TGT TAT TTG ACG CCAACAA 

BPIV-R：TCC CTC TAT CGA GTG GAA GAC ACT 

口蹄疫病毒： 

FMDV-L：GAACACATTCTTTACACCAGGAT 

FMDV-R：CATATCTTTGCCAATCAACATCAG 

牛腹泻病毒： 

BVDV-L：TGGTTCGACGCCTTGGTATA 

BVDV-R：CCCCGCTCAGGTTAAGATGT 

牛呼肠孤病毒： 

REO-L：GATCCTGATGTCTTGCGTCTAA 

REO-R：CAGCAGTATTCCCGTCGATAAT 

内标： 

IC-F-L：CTCGAGAACGCAAGTTC 

IC-F-R：GGTGATTTCACCTCCAGTAT 

靶核酸探针包括： 

牛副流感病毒： 

BPIV-P：TTG CGC TTG CAC C 

口蹄疫病毒： 

FMDV-P：ACAACCTACCGCCGAGCCAATTC 

牛腹泻病毒： 

BVDV-P：TGGTTCGACGCCTTGGTATA 

牛呼肠孤病毒： 

REO-P：AATTACGTGTGTCAAGGTGACGATGGA 

内标： 

IC-F-P：CACGACAGTGGTCGCTACATA 

(3)进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光信号； 

(4)根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有靶核酸存在于样品中。 

2.根据权利要求1所述的方法，使用该方法提取样品中的核酸系采用磁珠提取法提取，其特征在于步骤如下：向样品加入核酸萃取液，该核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液Tris-HCl，保温后加入磁珠，混合均匀，施加磁场后，弃去其中液体，然后两次洗涤，第一次洗涤使用包含高氯酸钠和乙醇的洗涤液，第二次洗涤使用包含乙醇的洗涤液，最后采用包含pH缓冲液Tris-HCl洗脱。 

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：每种靶核酸探针在所述单个PCR反应管中的浓度优选为5pmol/test。 

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：各种探针标记有不同的荧光基团，优选荧光基团是FAM，TAMRA，ROX，Cy5，HEX。 

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于反转录和PCR的条件为： 

42℃ 30分钟 50℃ 2分钟 94℃ 3分钟 

(94℃ 10秒 52℃ 10秒65℃ 45秒)45个循环， 

荧光采集FAM，TAMRA，ROX，Cy5，HEX。