[发明专利]甲型H7N9流感病毒(2013)核酸检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于第三类医疗器械-分子诊断领域，涉及一种使用荧光RT-PCR方法，结合FRET荧光探针对2013年甲型H7N9流感病毒进行检测的方法及试剂盒。

背景技术

H7N9型禽流感是用一种新型禽流感，于2013年3月底在上海和安徽两地率先发现。H7N9型禽流感是全球首次发现的新亚型流感病毒，至2013年4月初尚未有疫苗推出。被该病毒感染均在早期出现发热等症状，至2013年4月尚未证实此类病毒是否具有人传染人的特性。2013年4月经调查，H7N9禽流感病毒基因来自于东亚地区野鸟和中国上海、浙江、江苏鸡群的基因重配。

国家卫生和计划生育委员会发布的人感染H7N9禽流感诊疗方案（2013年第2版）指出，人感染H7N9禽流感潜伏期一般为7天以内。患者一般表现为流感样症状，如发热，咳嗽，少痰，可伴有头痛、肌肉酸痛和全身不适。重症患者病 情发展迅速，表现为重症肺炎，体温大多持续在39 以上，出现呼吸困难，可伴有咳血痰；可快速进展出现急性呼吸窘迫综合征、纵隔气肿、脓毒症、休克、意识障碍及急性肾损伤等。

核酸检测（nucleic acid testing，NAT）是直接检测病原体核酸的一系列技术的总称，可在尚未检测到抗原或抗体前，先检测到病毒核酸，其基本步骤包括核酸提取、扩增和检测。也就是常说的基因检测，是通过血液、其他体液或细胞对 DNA进行检测的技术，可以诊断疾病，也可以用于疾病风险的预测。由于核酸检测是直接检测病原体核酸，具有高敏感，高特异和短检测窗口期等优点，为疫病早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。 核酸检测技术已经从定性检测发展到实时荧光定量检测。针对有些临床需要，除能够依据阴阳性判断确证病例以外还可以依据核酸的载量判断感染程度。

检测设备根据国家标准，H7N9禽流感病毒的核酸检测采用的荧光RT-PCR检测需要实时荧光定量PCR仪用于定量检测，或PCR基因扩增仪用于定性检测，以及依据H7N9人感染禽流感的核酸特定序列研制的基于引物和探针的PCR检测试剂盒。

2013年4月2日，国家CDC 已经启动应急程序，将检测H7N9禽流感病毒的核酸检测PCR试剂探针及引物下发至各地方CDC和各个诊断实验室，以保证H7N9的准确诊断。

在此基础上，我们开发了一种检测2013年甲型H7N9流感病毒进行检测的方法及试剂盒，该试剂盒利用RT荧光PCR对2013年甲型H7N9流感病毒进行特异性的检测。

发明内容

1、本发明目的在于提供一种方法和试剂盒，这种试剂盒可以检测特异性的检2013年甲型H7N9流感病毒。

2、本试剂盒提供的方法可以在2管内完成2013年甲型H7N9流感病毒检测，加样后全程闭管检测，不需要开盖检测，极大的降低了实验室污染情况，而且操作简单。

3、本试剂盒引物设计使用MAP引物设计方法，将引物分为三段式引物，其中3~8个次黄嘌呤可以在序列的特定位置。

4、引物设计：引物设计使用MAP三段引物设计方法，其中n代表次黄嘌呤。

SEQ ID NO:1：GAGTCTGCTGCTAGnnnnnCAACAGG  

SEQ ID NO:2：GTCTGAAACCATACCnnnnnAACCATC

SEQ ID NO:3：GRGCTGCAATTGCnnnnnTCACACT

SEQ ID NO:4：CTTCCATTTGGATGTTnnnnnGGTGATGT

5、探针设计：SEQ ID NO:5: GTTCCTGAGATTCCAAAGGGAAGAGGCCTA

SEQ ID NO:6: CCTGAAACAACCAACACAAGCCA

本试剂盒采用单独的非竞争性模板作为内参设计区域，这样可以使引物之间的配合更好，不相互干扰，这种引物设计采取独特的环形引物设计，具体方法为在非竞争引物5’末端增加一段互补序列，成环的tm值要低于退火温度，这样当退火温度以下时。

6、固体反应物制备：

反应体系和固体反应物的制备：每人份反应物包括正向引物每种为0.4μM，负向引物浓度为10μM, 2ul dUTPs (2.5 mM of each dUTP),  5mM MgCl2,1.5U热启动聚合酶，0.2U焦磷酸酶、0.2U UNG酶、10%的海藻糖，1%的甘油，每种荧光探针100nM，以上混合液低温冻干，依据上面的分组，分为A颗粒和B颗粒。

7、阳性对照和阴性对照的制备：