[发明专利]一种以酿酒酵母孢子作为新型吸附剂的制备方法及应用

权利要求书

1.一种酿酒酵母孢子的制备方法，其特征在于：包括，

酿酒酵母单菌落的培养，采用基因同源重组的方法敲除负责编码酿酒酵母SK1孢子壁最外层二酪氨酸层DIT1基因，将得到的酿酒酵母缺陷菌株在YPAD固体培养基平板上划线，28℃～32℃培养长出酿酒酵母单菌落；

酿酒酵母孢子的制备，挑取酿酒酵母单菌落到YPAD固体培养基中培养22h～26h，然后将菌液转接到YPAce培养基中，培养后收集细胞，再转到浓度为1%～3%的醋酸钾溶液中培养，使得醋酸钾溶液中细胞的浓度为2×10⁷/ml～4×10⁷/ml，而后离心，将离心后的酿酒酵母菌体用PBS缓冲液洗涤，在36℃～38℃下用一定量的lyticase处理0.5h～1.5h后，进行超声波破碎，得到游离状态的酿酒酵母孢子。

2.根据权利要求1所述的酿酒酵母孢子的制备方法，其特征在于：还包括，对酿酒酵母孢子进行纯化和冷冻干燥处理。

3.根据权利要求2所述的酿酒酵母孢子的制备方法，其特征在于：所述对酿酒酵母孢子进行纯化，包括，

配制Percoll溶液，将处理过的细胞用0.5%Triton X-100溶液洗涤，以除去其中的裂解酶等杂质，然后将细胞悬浮在0.5%Triton X-100溶液中，配制不同梯度50%～80%不同浓度梯度的Percoll溶液；

酿酒酵母孢子的纯化，将所述Percoll溶液按照从高浓度到低浓度依次加入到离心管中，最后加酿酒酵母细胞悬浮液，离心，将上层液体除去，得到纯化的酿酒酵母孢子。

4.根据权利要求1所述的酿酒酵母孢子的制备方法，其特征在于：所述酿酒酵母单菌落的培养，包括，

引物设计，依据酿酒酵母DIT1基因序列设计引物如下：

上游引物P1

AATTTGTTAATATCCTAATTCGGTAAAGCTTTGTCGAGACATTAACAAAACGGATCCCCGGGTTAATTAA

下游引物P2

TGTTTAAGTAAAAGAACAAAAAGGTAGACCAATGTAGCGCTCTTACTTTAGAATTCGAGCTCGTTTAAAC；

PCR扩增，利用上游引物P1和下游引物P2对质粒pFA6a-His3MX6进行PCR扩增，获得含酿酒酵母DIT1基因上下游序列的敲除片段；

DIT1基因的敲除，通过醋酸锂/PEG的转化方法将PCR扩增得到的his片段分别导入到酿酒酵母SK1的单倍体细胞4B和16D中，并进行筛选；

缺陷性菌株的筛选，将DIT1基因的敲除后得到的转化菌株涂布到SD-His缺陷性平板上，待长出菌落后，挑取一定数目的菌落提取基因组，并进行PCR验证，以与野生型菌株的基因组进行对比，若验证成功，再将单倍体在SD-Leu-Arg平板上融合，得到缺陷性的二倍体菌株；

验证引物如下：

上游引物：CATAAATTGTGCTCCTCCGC

下游引物：CATTGCAGTGTCTCGAAACC。

5.根据权利要求1所述的酿酒酵母孢子的制备方法，其特征在于：所述酿酒酵母单菌落的培养，YPAD固体培养基的配制为酵母提取物10g，蛋白胨20g，腺嘌呤30mg，琼脂20g，定容于900mL蒸馏水中，121℃灭菌15min后，补加100mL单独灭菌的20%葡萄糖。

6.根据权利要求1所述的酿酒酵母孢子的制备方法，其特征在于：所述酿酒酵母孢子的制备，YPAce培养基的配制为酵母提取物10g，蛋白胨20g，腺嘌呤30mg，定容于900mL蒸馏水中，121℃灭菌15min后，补加100mL单独灭菌的20%醋酸钾。

7.一种如权利要求1～6所述的酿酒酵母孢子作为金属离子吸附剂的应用。

8.根据权利要求7所述的酿酒酵母孢子作为金属离子吸附剂的应用，其特征在于：

将所述酿酒酵母孢子进行纯化和冷冻干燥处理后得到酿酒酵母孢子粉末；

将所述酿酒酵母孢子粉末添加至含有金属离子的溶液中。

9.一种如权利要求1～6所述的酿酒酵母孢子作为脂肪类物质吸附剂的应用。

10.根据权利要求9所述的酿酒酵母孢子作为脂肪类物质吸附剂的应用，其特征在于：

将所述酿酒酵母孢子进行纯化和冷冻干燥处理后得到酿酒酵母孢子粉末；

将所述酿酒酵母孢子粉末添加至脂肪类物质中。