[发明专利]一种提高蓝莓花青素稳定性的处理方法

权利要求书

1.一种提高蓝莓花青素稳定性的处理方法，其步骤如下：

(1)蓝莓花青素提取

将-80℃下贮藏的蓝莓鲜果在0℃下解冻24小时，然后将蓝莓研磨成浆，按照料液比1∶4比例加入含0.5％三氟乙酸(TFA)的甲醇溶液，在0℃下封口、遮光搅拌提取24h。将提取液离心，5000r／min，15min，收集上清液。将上清液置于旋转蒸发器中旋蒸浓缩，控制温度在40℃，除去甲醇，得到浓缩液。

将浓缩液用1∶1(V∶V)乙酸乙酯萃洗，反复震荡，除去上层脂类物质，将此操作反复3次。将除去脂类的浓缩液依次通入离子交换树脂Amberlite XAD-7柱和Sephadex LH-20柱进行纯化，通入20倍柱体积含0.5％的三氟乙酸水溶液洗柱，流速2ml／min，除去非花青素化合物。然后通入含0.5％三氟乙酸甲醇溶液洗脱，收集洗脱液。将洗脱液于38℃下进行真空浓缩，然后置于冻干机中冻干，得到花青素粉末。

(2)酰基化试剂的制备

将无水没食子酸、无水乙酸酐、无水吡啶在0℃的条件下，以适应比例加入圆底烧瓶中，封口，在25℃的条件下搅拌反应10h。在反应结束后，向反应系统中加入5倍体积的10℃以下的去离子水，搅拌。再利用HCl溶液调整混合体系的pH至一定值，此时混合溶液中会出现沉淀，静止过夜。抽滤，收集沉淀产物。产物用少量冷水冲洗，在室温下进行真空干燥，得到白色粉末，即为三乙酰没食子酸。

以适应比例将三乙酰没食子酸和无水亚硫酰氯加入到圆底烧瓶中，在80℃的条件下不断搅拌下回流反应4h。反应过程中通过薄层色谱法(TLC)追踪反应的进度，用CCl₄溶解反应液点板，展开剂为1∶1的石油醚和乙酸乙酯混合液。当检测到没有三乙酰没食子酸剩余时，反应完成。在反应体系中加入二氯甲烷，溶解反应物，通过旋转蒸发仪在50℃的条件下除去反应体系中的多余的亚硫酰氯，晶体析出。收集析出的晶体，室温下进行真空干燥，得到干燥产物，即酰化剂三乙酰没食子酰氯(TGAC)的白色粉末，将其溶解于二氯甲烷中密封保存。

(3)蓝莓花青素酰化产物的制备

将制备得到的三乙酰没食子酰氯、蓝莓花青素提取样品和吡啶以适应比例溶于适量二氧六环中，(其中吡啶作为反应的催化剂)，在50℃的温度下回流反应4h。反应过程中需要不断搅拌。反应结束后，减压蒸出二氧六环和吡啶，加适量水稀释，得到产物晶体。过滤出产物，反复水洗，抽滤，晾干，真空干燥，得到酰化花青素的中间产物三乙酰没食子酰化花青素(TGAA)。

将三乙酰没食子酰化花青素溶于适量丙酮，在冰浴中降温至0℃在搅拌状态下滴入0.1mol／L的氢氧化钠溶液，调整pH至一定值，于0℃下静置3h。反应结束后用0.1mol／L盐酸溶液酸化至pH至一定值，减压蒸出丙酮，析出固形物，过滤后将固体产物溶于乙酸乙酯，酯层用水洗涤，减压蒸出乙酸乙酯，即得目标产物没食子酰化花青素(GAA)。

(4)HPLC测定酰化程度

没食子酸酰化花青素(GAA)中没食子酸的含量可以通过HPLC法测定。将没食子酸酰化花青素溶于质量分数10％的氢氧化钠溶液中，完全水解后，用HPLC测定水解液中没食子酸含量，并计算没食子酰化程度。

色谱柱：Shimpack VP-ODS色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈、甲酸；泵压：18.0MPa；流速：1.0mL／min；柱温：30℃；检测波长：530nm；进样量：10μL；检测时间：20min。其中，A：2％甲酸水溶液；B：100％乙腈。采用梯度洗脱方法：0～3min，10％B；3～9min，10％B→20％B；9～10min，20％B→30％B；10～13min，30％B→45％B；13～14min，45％B→50％B；14～18min，50％B→20％B；18～20min，20％B→10％B。

样品处理：(1)标准没食子酸样品：取0.17g定容至100mi，通过0.22μm滤膜，稀释100倍，得到17ppm浓度的标准样品。(2)没食子酸酰化花青素水解样品：取酰化花青素0.1g进行水解，加入1ml1.5mol／1NaOH，在30℃下以440r／min速度离心30min。取离心液200μl，调节pH至4.0，并通过0.22μm滤膜，稀释100倍，得实验样品。

2.根据权利要求1所述方法，在所述步骤(2)酰基化试剂的制备中，其特征是：无水没食子酸、无水乙酸酐、无水吡啶按1∶4∶4的质量比混合。