[发明专利]高抑制平滑肌细胞增生活性的大片段肝素寡糖分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及具有专一抑制平滑肌细胞增生活性的大片段肝素寡糖分离方法。 

背景技术

肝素是糖胺聚糖家族中一种高度硫酸化的重要成员。它在肥大细胞中合成后，被运输到各种组织器官中，因此其在生物体内广泛存在。生物体内肝素单链的分子量高达60,000－100,000Da，许多条肝素链又通过肽段连接，形成巨大蛋白聚糖分子。商用肝素分子量是由上述的糖胺聚糖降解而来的，巨型糖链在生产过程中多处被打断，形成了分子量范围大约在5000－25000Da之间产品。由此可以看出，肝素是由不同长度的混合链组成，链与链之间则又有差异，导致了肝素组分的高度异质性。根据对肝素链的组成和寡糖序列分析，现在已经基本清楚肝素的总体结构和组成。链中主要以糖醛酸残基（L-iduronic acid,IdoA;D-glucuronic acid,GlcA）和六糖胺(D-glucoamine)形式交替出现。 

肝素最早的临床用途是作为抗凝和抗血栓出现的。后来研究表明它还有抗平滑肌细胞增生、抗炎症、调节人体免疫功能等生物活性。同时它可以治疗和预防因外伤、哮喘、动脉粥样硬化、高血压、充血性心力衰竭、肺出血、肾炎综合症、急性肾小球肾炎、小儿先天性心脏病等引起的平滑肌增生，预防血管狭窄，避免或减少小儿和成人肺动脉高压症，预防和治疗冠心病和心肌梗塞患者经冠状动脉“搭桥术”“球囊扩充术”“安装支架术”和脑栓塞患者经“颅内血管分流术”平滑肌增生引起的心，脑血管再狭窄症(restenosis)。因此肝素具有多种药用的潜力。但是，肝素作为一种高度硫酸化的多糖，在使用过程中会引起明显的出血症状，这一主要的副作用限制了肝素的临床应用。 

解决这一问题的途径在于分别明确肝素中起抗凝活性的寡糖片段的结构和其它生物学活性的片段结构。 

到目前为止，肝素的抗凝活性寡糖片段是唯一被阐明的结构。它是一个含有3-o－硫酸基团五糖片段。 

肝素五糖与抗凝血酶的作用包括两个步骤：首先，五糖序列中非还原端三糖序列与ATIII形成一个低亲和性的识别复合物，诱导ATIII构象变化导致高亲和性复合物的形成。三糖序列能够完全激活ATIII，还原端的二糖序列对激活过程并不重要，但是它能稳定激活后的构象。 

除此而外，肝素的结构中其它生物学功能的结构域尚不清楚。 

特别是，某些具有高专一性生理活性的肝素寡糖混合物尚很难用简单的方法制备，制约了肝素寡糖药物的研制步伐。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种制备具有专一的抑制平滑肌细胞增生活性的大片段肝素寡糖药物的简单方法,以及用该种方法制备的大片段肝素专一高效抑制平滑肌细胞增生活性的能力。 

本发明所提供的制备具有抑制平滑肌细胞增生活性的肝素片段的方法，包括如下步骤： 

1.肝素酶的制备； 

2.肝素酶限制性裂解肝素底物； 

3.超滤膜分离有效肝素寡糖混合物； 

4.肝素寡糖混合物的抗平滑肌细胞活性； 

5.肝素寡糖混合物的抗肿瘤活性； 

6.肝素寡糖混合物的抗凝血活性。 

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 

1.肝素酶制备： 

（1）将所述发酵鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.HC-6155）CGMCC NO.0660接种于发酵培养基中，30℃培养40小时，离心收获菌体； 

所述发酵培养基组成由NaCl、K₂HPO₄、MgSO₄、肝素、大豆粉和水组成，NaCl在培养基中的浓度为1克/L，K₂HPO₄在培养基中的浓度为2.5克/L， MgSO₄在培养基中的浓度为0.5克/L，肝素在培养基中的浓度为2克/L，大豆粉在培养基中的浓度为2克/L。 

2）用渗透压稳定液悬浮所述菌体，12,000r/min离心20分钟，去掉上清液；再用低盐溶液悬浮所述菌体，12,000r/min离心20分钟，收集上清液，记作上清液Ⅰ；最后用高盐溶液再次悬浮所述菌体，12,000r/min离心20分钟，再次收集上清液，记作上清液Ⅱ；合并所述上清液Ⅰ和所述上清液Ⅱ，得到肝素酶粗酶液；