[发明专利]柱状黄杆菌基因重组疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和水产领域，具体的涉及一种能够预防草鱼免受柱状黄杆菌感染的疫苗制备方法。

背景技术

柱状黄杆菌分布广泛，是一种世界范围的水生动物致病菌。其宿主范围极为广泛，可感染包括鲤科、鲈科、鲶科、鲑科、太阳科、鲻科等多个科的鱼类，几乎所有的淡水鱼都对其敏感，在养殖或自然条件下海水鱼和观赏鱼也能感染发病。在美国，柱状黄杆菌是继爱德华氏菌后第二大影响斑点叉尾鮰养殖的病原菌，每年造成约100万美元的经济损失。在我国，柱状黄杆菌主要危害草鱼、鳜鱼、鲤鱼、鲫鱼等鱼类，其引起的柱形病居淡水鱼类细菌性病害之首，给我国水产养殖业造成了严重的危害。

目前，主要靠使用抗生素和消毒剂等化学药物进行柱形病的防治，虽然有一定的效果，但随着抗生素的长期使用和滥用而引起的抗药性菌株的出现、水产品药物残留、环境污染等负面影响已日趋引起人们的重视，在欧盟、挪威、美国、日本等国家，以抗生素为主的化学药物在水产养殖业中已逐渐被限用和禁用。开发新的防治方法迫在眉睫，其它防治途径相比，以疫苗为主的免疫防治方法具有针对性强、抗病周期长、效果显著、无毒无害等不可替代的优势，符合环境友好和可持续发展理念而日益受到人们的重视。

关于柱状黄杆菌疫苗的研究，现有技术主要有两方面的报道

(1)柱状黄杆菌灭活疫苗

将柱状黄杆菌接种于相应的培养基中，25℃培养至平台期，离心集菌，收集的沉淀菌体用生理盐水稀释到一定浓度。在菌液中加入终浓度为2％的苯酚或者0.5％的福尔马林25℃灭活24h，即为柱状黄杆菌灭活疫苗。

(2)柱状黄杆菌减毒活疫苗

将柱状黄杆菌在含利福平的培养基中反复传代，经过243次传代后，培养基中利福平的含量从5μg／mL逐渐上升至200μg／mL。逐渐使柱状黄杆菌的失致病性，离心集菌，用生理盐水调整细菌浓度，即为柱状黄杆菌减毒活疫苗。

柱状黄杆菌灭活疫苗成分复杂，稳定性不强且在灭活过程中会导致部分蛋白免疫原性丧失而影响其免疫效果。柱状黄杆菌减毒活疫苗，虽然具有较好的效果，但减毒活疫苗有回复突变的危险，存在安全隐患。

发明内容

本发明的目的是提供一种预防草鱼柱状黄杆菌的疫苗制备方法的制备方法及应用。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：

本发明一方面涉及一种柱状黄杆菌基因重组疫苗制备方法，所述的方法包括如下步骤：

(1)合成表1所示的引物：

表1所用到的引物

(2)提取柱状黄杆菌基因组，以柱状黄杆菌的基因组DNA为模版，以表1所示的引物进行PCR扩增表达片段；

(3)PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收DNA片段，分别连接到pMD-18T质粒上；

(4)pMD-18T质粒分别进行克隆，使用细菌质粒提取试剂盒提取pMD-18T质粒并进行双酶切，所使用的酶如表1所示；电泳切胶回收酶切片段；

(5)将酶切下来的五个基因片段以等体积混合，使用T4连接酶进行连接；

(6)将连接产物使用引物maz+和clsA-进行PCR扩增以获得五个基因的连接产物；

(7)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收DNA片段，将回收片段连接到pMD-18T载体上。

(8)对步骤(7)的pMD-18T载体进行克隆，使用细菌质粒提取试剂盒提取质粒并进行双酶切，所使用的酶为SacI和NcoI，电泳回收酶切片段；

(9)将步骤(8)中双酶切后的表达片段和用同样的内切酶同步酶切的pET-32(a)表达载体连接；

(10)连接产物转化DE3感受态细胞，PCR筛选重组克隆；

(11)取阳性克隆菌液1∶100接种于LB(含100μg／mL氨苄青霉素)液体培养基中，37℃、200rpm恒温摇床振荡培养至OD600为0.4～0.6。

(12)加入IPTG至终浓度为0.5mM，培养6h；4℃，5000g离心15min，去上清，收集菌体；用PBS重悬沉淀，4℃，10000g离心15min，去上清；加入1×结合缓冲液重悬菌体，冰上超生波破碎，200W，30s超声，30s间隔，8个循环；4℃，10000g离心15min，去上清，沉淀用含8M尿素的1×结合缓冲液重悬。冰上放置1h，使其彻底溶解；4℃，10000g离心30min，保留上清。