[发明专利]表达9家族糖苷水解酶基因CtAA9b的毕赤酵母工程菌株

说明书

（一）技术领域

本发明涉及生物工程，具体地说是一种表达具体地说是以嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum9家族糖苷水解酶基因CtAA9b的毕赤酵母工程菌株Pichia pastoris GS-CT-9B。

（二）背景技术

糖苷水解酶（英语：Glycoside hydrolases，又称糖苷酶）是一种专门水解配糖键（glycosidic bond），并产生两个较小的糖分子的酵素，也是自然界中的常见酵素之一。这类蛋白质在人类的产业上也有所应用，例如用来将纤维素与半纤维素等生物质能降解成可用的小分子。糖苷水解酶具有多个家族。

嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum是一种广泛分布于土壤中的嗜热真菌。该菌在微晶纤维素为唯一碳源的培养基中50℃条件下可以产生热稳定的纤维素酶和9家族糖苷水解酶。

嗜热毛壳菌产生的9家族糖苷水解酶CtAA9B具有微弱的纤维素酶活性，但对该菌株产生的内切纤维素酶N24的酶活性具有明显的促进作用,可使其活性提高1.7倍。在不同金属离子如Mn²⁺的作用下，CtAA9B和CtAA9B+N24的活性可分别提高15倍和2.54倍。

（三）发明内容

本发明从嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum获得内切β-1,4-葡聚糖酶基因的cDNA序列全长，命名为CtAA9b，CtAA9b基因DNA全长1041bp，包括信号肽序列，起始密码子和终止密码子，编码322个氨基酸，具有信号肽序列（1-24aa MVKAKKSAFLATVAGASLVAAHGY）。将CtAA9b编码的氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现属于糖苷水解酶第9家族。

构建重组表达质粒载体pPIC9K/CtAA9b，利用电转仪进行电击转化Pichia pastoris GS115，在MD和MM培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳性转化子，G418筛选多拷贝转化子，然后进行甲醇诱导表达，获得毕赤酵母工程菌株GS-CT-9B。该工程菌株接种于含BMGY培养基中，在28℃200rpm/min摇床培养6d后，糖苷水解酶的表达量为3.16mg/ml，分子量为55KDa，酶活力为0.0365U/ml，CtAA9b在65℃下是稳定的，处理60min后仍有95%以上的酶活性；70℃处理30min后仍保持64%的活性；80℃处理30min后保持13.5%的活性；90℃处理30min活性几乎完全丧失。

9家族糖苷水解酶CtAA9B对嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum内切纤维素酶N24的酶活性具有明显的促进作用，混合酶比原始酶N24的降解纤维素的能力提高1.7倍。不同金属离子对CtAA9B和CtAA9B+N24混合酶活性具有促进或抑制作用，其中在Mn²⁺条件下，CtAA9B和CtAA9B+N24的纤维素酶活性可分别提高33倍和2.54倍。

（四）附图说明：

图19家族糖苷水解酶CtAA9B的SDS-PAGE分析

泳道1：低分子量蛋白标准

泳道2：纯化的9家族糖苷水解酶CtAA9B

图2A:9家族糖苷水解酶CtAA9B的最适温度

B:9家族糖苷水解酶CtAA9B的热稳定性测定

图39家族糖苷水解酶CtAA9B对内切纤维素酶N24活性的促进作用

图4金属离子Mn²⁺对CtAA9B纤维素酶及混合酶活性的影响

（五）具体实施方式

实施例1：嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum的分离鉴定

（1）标本采集：从堆肥中采集。

（2）分离培养：将采集标本取0.5克放置在PDA平板上50℃培养3天后，进行分离纯化。操作步骤参考Cooney and Emerson(1964)文献。

（3）鉴定:参考Cooney and Emerson(1964)和LaTouche(1950)文献。

实施例2：糖苷水解酶基因CtAA9b的克隆

（1）嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum总RNA的提取：参照Trizol试剂盒说明。