[发明专利]利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法

权利要求书

1.一种利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法，其特征在于以糖蜜为原料，采用固定化米曲霉发酵经酸解预处理的糖蜜。

2.根据权利要求1所述的利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）米曲霉孢子的制备；

（2）米曲霉孢子悬浮液的制备；

（3）将米曲霉孢子固定到聚氨酯泡沫载体上；

（4）固定化米曲霉的准备；

（5）糖蜜的酸处理；

（6）固定化米曲霉接种到以糖蜜为原料的培养基中进行发酵产酸。

3.根据权利要求2所述的利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法，其特征在于步骤（1）按以下操作进行：将米曲霉孢子划线接种到PDA试管斜面培养基上，在温度为30℃条件下培养4天，再将米曲霉孢子划线接种到PDA试管斜面培养基上培养，同法反复传代3～4代活化菌种，待孢子完全覆盖菌丝表面，即得。

4.根据权利要求3所述的利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法，其特征在于步骤（2）按以下操作进行：用无菌生理盐水将步骤（1）获得的米曲霉孢子洗脱下来，孢子洗脱液在超声清洗仪中处理10s，充分打散孢子，再经4层纱布过滤除去菌丝体，将种子培养基缓慢加入到经过滤的孢子悬浮液中，使最终的孢子浓度为10⁷～10⁶个/mL，即得。

5.根据权利要求4所述的利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法，其特征在于步骤（3）按以下操作进行：采用边长为2～6mm的正方体聚氨酯泡沫载体，高温高压灭菌，冷却；将步骤（2）获得的孢子悬浮液按体积比1∶2与固定化载体混合，反复按压载体，使悬浮液填充载体内部；30℃条件静置下培养24h，待孢子萌发、生长并缠绕在载体上后，用无菌生理盐水反复冲洗3～4次，除去未固定的菌丝体，即得。

6.根据权利要求5所述的利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法，其特征在于步骤（4）按以下操作进行：按照体积比2∶5的接种量将步骤（3）获得的固定化米曲霉添加到种子培养基中，种子培养基装液量为100mL/250mL三角瓶，30℃条件下，200rpm摇瓶培养3～4d，形成固定化菌体，过滤，保留固定化菌体，即得。

7.根据权利要求6所述的利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法，其特征在于步骤（5）按以下操作进行：糖蜜与水按照体积比1∶1进行混合稀释，再用质量浓度为10%的稀硫酸调节糖蜜稀释液pH至3.0，95～100℃保温10min，静置过夜，取上清液；用质量浓度为15%的石灰乳回调上清液pH至6.0，40℃保温10min，4000rpm离心10min，取上清液，备用。

8.根据权利要求7所述的利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法，其特征在于步骤（6）按以下操作进行：在三角摇瓶中进行曲酸发酵生产，发酵培养基装液量为40～60mL/250mL，固定化菌体按照发酵培养基体积的5～15%添加，发酵温度为28～30℃，摇床转速为180～220rpm，发酵10天；所述发酵培养基为用水稀释过的步骤（5）获得的酸处理过的糖蜜，调节糖蜜中总糖浓度为60～100g/L，调节pH4.0～6.0，高温高压灭菌，菌体接种前，向培养基中添加一定体积的无水乙醇，使发酵培养基中的乙醇浓度达到20mL/L。

9.根据权利要求8所述的利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法，其特征在于：所述种子培养基含有蔗糖60g/L、酵母膏5g/L、KH₂PO₄1g/L、KCl0.5g/L、MgSO₄·7H₂O0.5g/L、乙醇20mL/L，pH6.0。