[发明专利]多重PCR检测志贺氏菌群/血清型的引物组和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属微生物检测领域，涉及志贺氏菌群/血清型的多重快速PCR检测引物组和试剂盒。

背景技术

志贺氏菌是一类具有高度传染性、危害严重的革兰阴性肠道致病菌，由其临床感染所导致的志贺氏菌性痢疾（shigellosis）是发展中国家重要的传染病之一，也是发达国家腹泻病的主要病原。全球每年的志贺氏菌性痢疾病例近1.65亿例，其中1.63亿发生在发展中国家，并导致110万患者死亡，其中60%以上为5岁以下儿童。我国广大农村地区由于卫生条件差，经常有因水源或食品受志贺氏菌污染而引起痢疾、腹泻等疾病流行的报道。

志贺氏菌为志贺氏菌属，分为四个种群：痢疾志贺氏菌（A群）、福氏志贺氏菌（B群）、鲍氏志贺氏菌（C群）和宋内志贺氏菌（D群）。志贺氏菌抗原由菌体抗原（O抗原）和荚膜抗原（K抗原）组成，O抗原的特异性好，据此可对志贺氏菌进行血清学分型。痢疾志贺氏菌有13个血清型，福氏志贺氏菌有6个血清型，鲍氏志贺氏菌有18个血清型，宋内志贺氏菌只有一个血清型。其中，福氏志贺氏菌6型与1-5型O抗原差异较大。四个群的志贺氏菌均可引起痢疾。根据志贺氏菌的菌型分布调查，我国以福氏和宋内志贺氏菌感染为主；痢疾志贺氏菌1型是志贺氏菌暴发的最主要菌株。近年来，痢疾志贺氏菌Ⅰ型引起的细菌性痢疾已发展为世界性流行趋势，我国至少在10个省、区发生了不同规模流行。其他型的痢疾志贺氏菌和鲍氏志贺氏菌则较少见。

我国对志贺氏菌检测目前采用的主要方法是以国家标准GB/T4789.5-2012作为依据，采用细菌分离培养、生化反应和血清学方法鉴定群和血清型。整个检测获得最终结果需要5天左右，既费时又费力，且受限于数据库信息有限。同时，挑选菌落不全、菌落不纯、菌液浓度过高或过低均会影响最终结果的呈现。

分子生物学检测方法为志贺氏菌检测提供了良好的检测工具，目前国内外均建立了采用PCR技术对志贺氏菌进行快速检测的技术。比如中国专利申请号为200710030435.0的发明专利“志贺氏菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒”，提供了一种基于环介导等温扩增技术检测试剂盒，试剂盒通过一组志贺氏菌检测引物组和包含该引物组的试剂盒检测标本中志贺氏菌的特定基因片段，以确定标本中志贺氏菌的存在情况。中国专利申请号为200710026604.3的发明专利“一种检测志贺氏菌及其ipah毒力岛的方法及其试剂盒”，提供了检测临床样本中志贺氏菌属和ipah毒力岛的方法及试剂，特别是涉及以实时荧光定量聚合酶链式反应技术检测志贺氏菌属细菌的方法和试剂盒。中国专利申请号为200510132404.7的发明专利“用于志贺氏菌血清型检测的基因芯片及其检测方法和检测用试剂盒”，提供了一种用于志贺氏菌血清型检测的基因芯片及其检测方法和检测用试剂盒，通过引物扩增16S rRNA、O抗原编码基因，将PCR产物与固相芯片进行杂交以检测志贺氏菌的不同血清型。

采用单重PCR或实时荧光PCR可以快速的鉴定志贺氏菌种属，但对群和血清型仍需通过分离培养、生化反应和血清学方法鉴定。由于食品和临床标本成分复杂，提取后的核酸仍有可能带有PCR抑制成分，出现假阴性的结果，造成志贺氏菌的漏检。

生物芯片可以对志贺氏菌的群和血清型进行系统的鉴定，但进行生物芯片检测需要配备昂贵的仪器，稳定性差、重现率低等技术难题和昂贵的成本仍制约它进一步发展和应用。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种多重PCR检测志贺氏菌群/血清型的引物组和试剂盒，可快速、特异且敏感地判定志贺氏菌属及鉴别志贺氏菌群和血清型，建立一种基于普通PCR平台的多重PCR检测方法。

为了实现本发明目的，本发明首先提供了设计和筛选特异性引物的技术方案及一种多重PCR检测志贺氏菌群/血清型的引物组：

1、设计阳性内对照（IAC）扩增引物和模板：

以pET28a质粒为模板设计一对引物，扩增其中的1176bp大小的片段，作为检测的IAC。IAC上游引物序列为5’-TGCAGGTCGACTCTAGAGGA-3’，IAC下游引物的序列为5’-TTCGAGCTCGGTACCCGGGGA-3’。pET28a的碱基序列如SEQ ID No.13所示。

2、选择志贺氏菌属的检测靶点

侵袭性质粒抗原H（ipaH）存在于所有群和血清型的志贺氏菌中，以多拷贝存在于染色体和侵袭性大质粒上，不随传代消失，是比较理想的检测志贺氏菌属的靶点。可通过检测ipaH基因的扩增来判定志贺氏菌属。

3、选择O抗原特异性的群和血清型鉴定引物