[发明专利]分枝杆菌属检测试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种分枝杆菌属检测试剂盒，其特征在于，所述的分枝杆菌属检测试剂盒包括以分枝杆菌属的hsp65基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物：内引物FIP/BIP和外引物F3/B3，所述的两对引物为

外引物F3’：

AGTCCATCGGTGACCTGATC

外引物B3’：

AGGACCGCCTCCTGAC

内引物FIP’：

GGTGTTGGACTCCTCGACGGGCCGAGGCGATGGACAA

内引物BIP’：

GCAGCTCGAGCTCACCGAGCGGGTCGGTCACGAAGT。

2.根据权利要求1所述的分枝杆菌属检测试剂盒，其特征在于，所述的分枝杆菌属检测试剂盒还包括BstDNA聚合酶、反应液、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对照液。

3.根据权利要求2所述的分枝杆菌属检测试剂盒，其特征在于，

所述的BstDNA聚合酶：酶浓度4-10U/μL；

所述的反应液含：1.6～2mmol/LdNTP、20～25mmol/LTris-HCl、10～12.5mmol/LKCl、10～12.5mmol/L（NH₄）₂SO₄、8～10mmol/LMgSO₄、0.1～0.125体积％TritonX-100、0.8～1mol/L甜菜碱；

所述的样品预处理液含：10～20mmol/LpH8.0的Tris-HCl、1～2mmol/LEDTA和1～1.2体积%TritonX-100；

所述的显色液为SYBRGreenI或EvaGreen；

所述稳定液为石蜡油；

所述的阳性对照为BCG基因组DNA；

所述的内引物FIP/BIP各为0.2～0.25μmol/L，外引物F3/B3的浓度各为1.2～2.0μmol/L。

4.根据权利要求3所述的分枝杆菌属检测试剂盒，其特征在于，

所述的BstDNA聚合酶：酶浓度8U/μL；

所述的反应液含：2mmol/LdNTP、25mmol/LTris-HCl、12.5mmol/LKCl、12.5mmol/L（NH₄）₂SO₄、10mmol/LMgSO₄、0.125体积％TritonX-100、1mol/L甜菜碱；

所述的样品预处理液含：20mmol/LpH8.0的Tris-HCl、2mmol/LEDTA和1.2体积%TritonX-100；

所述的显色液为SYBRGreenI；

所述的内引物FIP/BIP的浓度各为0.2μmol/L；

所述的外引物F3/B3的浓度各为1.6μmol/L。

5.根据权利要求2、3或4所述的分枝杆菌属检测试剂盒，其特征在于，所述的分枝杆菌属检测试剂盒还包括反应管，所述的反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板。

6.根据权利要求5所述的分枝杆菌属检测试剂盒，其特征在于，所述的A、B两个空腔中分别装有工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由稳定液封存，所述工作液为反应液和BstDNA聚合酶的混合而成。

7.一种使用如权利要求2所述的分枝杆菌属检测试剂盒的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（1）将待测样品离心，去上清，得到沉淀；

（2）将步骤（1）的沉淀加入样品预处理液，混合均匀，沸水浴灭活后冰上冷却，高速离心，上清即为样品模板DNA；

（3）在反应容器中加入BstDNA聚合酶0.9～1.8体积份数、反应液38～40体积份数、稳定液52～54.5体积份数、样品模板DNA4.5～9体积份数、内引物FIP/BIP各2体积份数、外引物F3/B3各4体积份数，恒温反应；

（4）在上述反应容器和阳性对照中分别加入显色液，混匀，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性；

所述步骤（3）中的内引物FIP/BIP和外引物F3/B3为以分枝杆菌属的hsp65基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物。

8.根据权利要求7所述的使用分枝杆菌属检测试剂盒的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，恒温反应的反应条件为温度63～65℃，反应时间45～90min。