[发明专利]一种提取鱼软骨中硫酸软骨素的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种提取鱼软骨中硫酸软骨素的方法。

背景技术

    硫酸软骨素是自哺乳动物气管等软骨提取而得的酸性黏多糖。白色粉末，无臭，无味，易吸湿，易溶于水，不溶于乙醇和丙酮等有机溶剂，遇水即膨胀或成黏浆，对热较不稳定。需避光密封保存。软骨素由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-半乳糖胺组成的黏多糖。硫酸软骨素是软骨素的硫酸酯，构成结缔组织的主要成分。它具有澄清脂质，提高机体解毒功能，利尿和镇痛等作用。对胶原性疾患十分有效，对由链霉素引起的听觉障碍也有效果。酸性黏多糖是生物体内结缔组织基质中特有成分之一，硫酸软骨素A为酸性黏多糖之一种。医疗上用于冠心病防治。

根据硫酸基在半乳糖上位置不同主要分为硫酸软骨素A (CSA)硫酸软骨素C (CSC)。近年来研究发现，硫酸软骨素（CS）的相对分子量较大，它的大体积往往妨碍其顺利的穿越细胞膜，因而不能在机体内良好发挥其多种药理功能，而低分子量的硫酸软骨素（LMWCHS）具有粘度小、溶解性好、易吸收及生物利用度高等特点。

近年来，小分子硫酸软骨素在防治冠心病、关节炎以及抗肿瘤等方面正日益受到广泛重视，小分子硫酸软骨素的制备主要通过硫酸软骨素酶酶解获得。硫酸软骨素酶是一类主要存在于微生物体内，能将多种酸性粘多糖如硫酸皮肤素、硫酸软骨素、透明质酸等降解为寡糖及不饱和二糖的裂解酶。

目前由于硫酸软骨素酶产量低，价格昂贵，严重制约了小分子硫酸软骨素行业的发展，如何发明一种高效、操作方便、生产周期短、适合大规模工艺化生产的方法，从而生产出小分子的硫酸软骨素，具有极其重要的意义。

发明内容

本发明为了克服现有技术中存在的上述缺点，提供了一种提取鱼软骨中硫酸软骨素的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）微生物初筛：用无菌水将土样悬浮制成10%的土壤溶液，两层滤纸抽滤后得澄清液体，将液体梯度稀释至10^-5，取稀释液0.3ml涂布分离培养基平板培养，将单菌落用平板划线分离方法在分离培养基平板上纯化2次，挑取纯化后的单菌落点种于初筛培养基平板，32℃温箱中培养6-7天后，向平板中倒入6ml 3mol/L的冰醋酸，浸泡3min，将产生透明圈的菌株利用划线法保存于试管固体斜面培养基上并于4℃保存待用；

（2）微生物复筛：将产生透明圈的菌体接种于复筛培养基中，32℃，135r/min振荡通气培养2天，将菌液梯度稀释至10^-9，取0.3ml 10^-7、10^-8、10^-9的菌液，涂布于初筛培养基中，在32℃温箱中培养6-7天后，通过测量挑选透明圈相对于菌落较大的菌株，接种于复筛培养基中，32℃、135r/min振荡通气培养24h，经平板菌落计数得菌体密度为2×10⁷-3×10⁷个/ml作为种子菌液，肉眼观察菌落的形态特征；

（3）发酵培养：按2-2.5% v/v接种量将种子菌液接入5L发酵罐中通过发酵培养基发酵，28-32℃，发酵55-65h；

（4）提取硫酸软骨素酶：将所得发酵液置于离心机中，4℃、4200r/min离心35min,弃去菌体沉淀，冰浴，在磁力搅拌器的搅拌下，缓缓向发酵上清液中加入硫酸铵至90%的饱和度，4℃层析柜中静置2天,然后4℃、4200r/min再次离心发酵液，收集蛋白沉淀，利用三蒸水溶解并置于透析袋中，于4℃层析柜中透析脱盐，在(NH₄)₂SO₄溶液检测透析袋外液体不含SO₄^2-的情况下，冷冻干燥；

（5）软骨预处理：选择鱼软骨脱脂后将其粉碎，加入3-5％的氢NaOH溶液和氯化钠溶液在温度为50-60℃的条件下提取5-6h，过滤后调滤液pH=8-9 ；

（6）酶解超滤：向上述滤液加入软骨投料重量3-5％的步骤（4）制作的硫酸软骨素酶粉，在pH 值为6-7，温度为40-50℃的条件下酶解5-6h，在室温下用截留分子量为8000的超滤膜超滤脱水浓缩至原体积的2/3 ； 

（7）制硫酸软骨素：将超滤脱水后的浓缩液调pH 值为8-9，加入为软骨投料重量2-3％的双氧水，在温度为25-35℃的条件下氧化5-6h过滤，滤液调pH 值为5-6，加入95％乙醇结晶，使乙醇浓度达65-75％，结晶后离心、洗涤、干燥后得到鱼硫酸软骨素。