[发明专利]麦二叉蚜特异性SS-COI引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及麦二叉蚜特异性SS-COI引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法。

背景技术

麦二叉蚜Schizaphis graminum（Rondani）属半翅目蚜科，全国均有分布。其寄主植物有小麦、大麦、燕麦、高粱、水稻、狗尾草、莎草等禾本科植物。麦二叉蚜常在麦类叶片正、反两面或基部叶鞘内外吸食汁液，致麦苗黄枯或伏地不能拔节，严重的麦株不能正常抽穗，直接影响产量，此外还可传播小麦黄矮病。

麦二叉蚜在田间有多种捕食性天敌（如瓢虫、草蛉、蜘蛛等），天敌的保护和利用是麦二叉蚜防治的重要措施。明确不同时期、不同种类捕食性天敌对麦二叉蚜种群的控制作用，对于天敌保育利用以及其他防治措施的实施均具有指导意义。但通过传统的天敌捕食作用研究方法，不能准确评估天敌对每种蚜虫的控害作用。

Species-Specific-COI PCR检测技术是在mtDNA COI技术基础上发展起来的特异序列扩增区域标记，是利用特异性的引物，根据预期DNA条带的有无来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且重现性和稳定性强等优点，为准确评价天敌对猎物的捕食作用开辟了新途径。

发明内容

本发明的目的是提供麦二叉蚜特异性SS-COI引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法。

为了实现本发明目的，本发明根据麦二叉蚜的线粒体DNA序列，设计一对麦二叉蚜特异性SS-COI引物，其包括：

正向引物LFSgF：5′-CATTATCTAATAATATTGCTCATAAC-3’

反向引物LFSgR：5’-TGATAAAATTAATAAAATAGCTGTG-3’。

本发明还提供含有引物LFSgF和LFSgR的用于检测麦二叉蚜的试剂盒。所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的至少一种。优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明还提供所述引物LFSgF和LFSgR，以及含有引物LFSgF和LFSgR的试剂盒在检测麦二叉蚜中的应用。

本发明还提供一种麦二叉蚜的特异性快速PCR检测方法，包括以下步骤：

1）提取样品DNA；

2）以步骤1）提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物LFSgF和LFSgR进行PCR扩增反应；

3）分析PCR产物。

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若出现大小为203bp的DNA扩增条带（SEQ ID No.3），则判定样品为麦二叉蚜。

本发明根据GenBank中公布的麦二叉蚜COI（JX966075）的一段基因序列，设计一对特异性引物，该引物特异性强，只对麦二叉蚜具有扩增能力，而对我国华北棉区内棉田中的主要昆虫无扩增产物。采用本发明提供的方法和引物检测麦二叉蚜，准确性高，可扩增出203bp大小的片段。采用SS-COI PCR技术检测麦二叉蚜，是对RAPD技术、RFLP技术和mtDNA COI检测技术的补充和改进，SS-COI PCR检测技术操作简单、快速、高效，一般可在5个小时内完成检测，且具有较高的灵敏度，质粒浓度检出限为9.62E+03，DNA浓度检出限为0.341ng/μL。

附图说明

图1为本发明实施例1中麦二叉蚜特异性引物LFSgF/LFSgR的PCR检测结果；其中，M：DNA分子量标准2000bp ladder；1-114为表1中序号所对应昆虫的扩增结果，-为阴性对照。

图2为本发明实施例2中麦二叉蚜特异性引物LFSgF/LFSgR的DNA浓度梯度检测结果；其中，M：DNA分子量标准5000bp ladder；1-12为模板DNA浓度341.8ng/μL依次10倍稀释浓度梯度；-为阴性对照。

图3为本发明实施例2中麦二叉蚜特异性引物LFSgF/LFSgR的质粒浓度梯度检测结果；其中，M：DNA分子量标准2000bp ladder；1-8为模板质粒浓度9.62E+10依次10倍稀释浓度梯度；-为阴性对照。

具体实施方式