[发明专利]一种基因工程菌及其生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法

权利要求书

1.一种高效表达谷氨酰胺转胺酶酶原的基因工程菌，其特征在于，用来自吸水链霉菌CCTCC M203062的谷氨酰胺转胺酶酶原，构建重组表达载体pINA1297-proTG，并将其转化解脂耶氏酵母，得到基因工程菌pINA1297-proTG/Y.lipolytica WSH-Z06。

2.根据权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述谷氨酰胺转胺酶酶原扩增自载体pET22b(+)/proTG或根据Genebank：EU477523合成。

3.一种发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法，其特征在于，用来自吸水链霉菌CCTCC M203062的谷氨酰胺转胺酶酶原，构建重组表达载体pINA1297-proTG，并将其转化解脂耶氏酵母得到重组菌，利用重组菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤如下：

1）将谷氨酰胺转胺酶酶原基因和质粒pINA1297分别进行SfiI单酶切，然后加入KpnI酶切，酶切片段进行柱回收，酶切质粒pINA1297进行胶回收，将二者连接过夜，转化大肠杆菌感受态细胞，使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子；

2）将经验证构建成功的重组质粒pINA1297-proTG用NotI线性化，胶回收片段转化至解脂耶氏酵母得到重组菌；

3）利用重组菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原。

5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤如下：

1）扩增得到谷氨酰胺转胺酶酶原的PCR产物；

2）将回收的谷氨酰胺转胺酶酶原的PCR产物片段和质粒pINA1297分别进行SfiI单酶切，然后加入KpnI酶切，酶切片段进行柱回收，酶切质粒pINA1297进行胶回收，将二者连接过夜，转化大肠杆菌感受态细胞，使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子；

3）将经验证构建成功的重组质粒pINA1297-proTG用NotI线性化，胶回收片段转化至解脂耶氏酵母得到重组菌；

4）利用重组菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原。

6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述谷氨酰胺转胺酶酶原扩增自载体pET22b(+)/proTG。

7.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述谷氨酰胺转胺酶酶原扩增引物为：

P1：5’-TTGGGCCGTTCTGGCC GCCAGCGGCGGCGACG-3’

P2:5’-CGCGGATCC TTACGACCAGCCCTGCTTCACCTC-3’。

8.根据权利要求3所述方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)谷氨酰胺转胺酶酶原引物设计

根据pET22b(+)/proTG基因序列设计谷氨酰胺转胺酶酶原基因的PCR引物P1和P2

P1：5’-TTGGGCCGTTCTGGCC GCCAGCGGCGGCGACG-3’

P2:5’-CGCGGATCC TTACGACCAGCCCTGCTTCACCTC-3’；

2)重组表达载体pINA1297-proTG的构建

利用引物P1，P2，以pET22b(+)/proTG质粒为模板，扩增得到谷氨酰胺转胺酶酶原的PCR产物，按照胶回收试剂盒说明书回收PCR产物，将回收到的片段和质粒pINA1297分别进行SfiI单酶切，50℃，1h，然后加入KpnI酶切，37℃，45min后，酶切片段进行柱回收，酶切质粒pINA1297进行胶回收，将二者按一定比例连接过夜，转化E.coli JM109感受态细胞，使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子，提取转化子质粒，重组质粒经SfiI单酶切，50℃，1h,再经KpnI酶切，37℃，45min，释放出大小为5.2kb和1.1kb的基因片段，证明重组质粒构建成功，重组质粒命名为p INA1297-proTG；

3)重组质粒p INA1297-proTG转化解脂耶氏酵母

将经验证构建成功的重组质粒p INA1297-proTG用NotI线性化，胶回收片段转化至解脂耶氏酵母中；

4)转化子基因组插入片段检测

挑取YNB平板上解脂耶氏酵母单菌落接种于YPD液体培养基中，提取菌株的基因组DNA，具体操作步骤按照天根提酵母基因组试剂盒说明书进行，以P1，P2为引物，基因组DNA为模板，进行PCR验证；

5）利用重组菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原。